量化转基因 埃及伊蚊 的适应性成本

摘要

本方案描述了如何测量 埃及伊蚊 的常见生活参数数据，包括繁殖力、翅膀大小、生育能力、性别比例、生存能力、发育时间、雄性贡献和成虫寿命。这些测量结果可用于评估转基因蚊子的适应性。

摘要

与野生型蚊子相比，转基因蚊子通常表现出适应成本。在这方面，适应性成本研究涉及从转基因蚊子那里收集生命参数数据，并将它们与来自相同遗传背景的缺乏转基因的蚊子进行比较。这份手稿说明了如何测量 埃及伊蚊的常见生活史特征，包括繁殖力、翅膀大小和形状、生育能力、性别比例、生存能力、发育时间、雄性贡献和成年寿命。之所以选择这些参数，是因为它们反映了繁殖成功率，易于测量，并且通常在文献中报道。代表性结果量化了与基因敲除或基因驱动元件的单次插入相关的适应性成本。标准化生命参数数据的收集方式非常重要，因为此类数据可用于比较不同研究中产生的转基因蚊子的健康状况，或用于模拟野生型蚊子种群中的转基因固定率。虽然该方案是针对转基因 埃及伊蚊的，但该方案也可用于其他蚊子物种或其他实验处理条件，但需要注意的是，某些生物学环境可能需要特殊适应。

引言

适者生存是达尔文的观点，即拥有最能适应环境的基因的个体会将这些基因传递给后代¹.这意味着，健康状况决定了他们的基因是否能够存活。这个已有150多年历史的概念可能是在转基因蚊子中成功设计基因驱动的最重要决定因素。基因驱动，或自私的遗传元件的超孟德尔遗传模式，使其能够在群体中传播²，正在探索用于遗传害虫管理³。在病媒控制方面，该战略旨在用对病原体具有抵抗力的节肢动物取代野生型节肢动物（种群改造），或将它们全部消灭（种群抑制）⁴。然而，与它们的 WT 蚊子相比，转基因蚊子通常表现出适应成本（也称为遗传负荷），这意味着转基因蚊子将在可以胜过它们的种群中丢失。因此，将转基因与基因驱动系统偶联是必要的，以抵消任何适应成本，并将转基因在群体中的水平提高到高于典型孟德尔遗传预期的水平⁴。

对蚊子媒介物种的实验室研究表明，转基因通常显示健身成本 ^5,6,7。例如，Irvin 等人。 测量了埃及伊蚊 （Ae.） 在果蝇肌动蛋白 5C 或合成 3XP3 启动子下表达增强绿色荧光蛋白 （eGFP） 或转座酶基因的各种生命参数，并将它们与野生型奥兰多菌株（它们来源的相同遗传背景）⁵。最值得注意的是，他们发现所有转基因菌株都显着降低了生殖适应性⁵。依赖转基因，一些表达抑制疟原虫寄生虫发育的转基因的按蚊（An.）蚊子也表现出适应性成本⁶。具体来说，与对照组相比，在组成型或血粉诱导启动子下表达蜂毒磷脂酶 （PLA2） 的 An. stephensi 产卵明显减少⁶.这些作者还发现，表达不同转基因（SM1十二肽四聚体）的转基因按蚊不表现出适应成本，这使他们得出结论，转基因赋予的适应成本至少可能部分取决于产生的转基因蛋白质的影响⁶。事实上，适应成本可能归因于实验室培育菌株的转基因产物、位置效应、脱靶效应、插入诱变或近亲繁殖效应⁷.因此，基因驱动必须足够强大，以抵消这些转基因诱导的适应成本，同时还要避免阻塞驱动本身的插入和缺失（插入缺失）的发展。

发育或生殖健康成本可以在实验室或笼子研究中测量⁷，但需要注意的是，该领域的未知因素也可能产生影响。尽管如此，在规划或评估转基因蚊子释放（例如基因驱动计划）时，受控适应性研究是重要的第一步，以确定转基因系是否会在后代中持续存在。例如，Hammond 等人。 评估 冈比亚基于 CRISPR/Cas9 的基因驱动旨在破坏女性生育能力所需的基因⁸.通过维持至少25代的笼子研究，作者发现蚊子产生了基因驱动的抗性等位基因，这些等位基因阻断了CRISPR靶向切割并恢复了女性的生育能力⁸。他们的建模工作表明，在模拟条件下，基因驱动的雌性杂合子的生育能力对基因驱动固定的影响最为显着⁸。按照同样的思路，埃及伊蚊（希格斯白眼菌株，HWE）被设计为在不同的启动子或不同的基因间位点下表达自主基因驱动盒，在模拟群体中表现出不同的基因驱动固定^率9。使用 MGDrivE 模型¹⁰，结合测量的插入缺失形成率、母体效应和实验室收集的生命参数数据，作者发现蚊子的适应性对基因驱动的持久性影响最大 在模拟条件下⁹.最有可能损害基因驱动效率的适应成本归因于体细胞Cas9（过）表达或来自靶向基因，特别是在杂合子中，而不是内在驱动本身11,12,13,14,15,16,17。

鉴于其重要性，适应性是转基因品系在后代中持续存在能力的重要因素，它可以用作与转基因相关的任何生理效应的指标。例如，脱靶效应可能与健身成本有关。在这种情况下，建议将转基因系回交几代。此外，将转基因系与反映田间群体的转基因系交叉，对于研究转基因群体在现实世界中的竞争能力也是必要的。为了量化适应性成本以便它们具有可比性，本手稿提供了简单的协议，用于测量埃及蚊子中常见的生活史特征，特别强调与转基因相关的适应性成本，以便此类研究更容易复制。协议包括生育能力、生育能力、性别比例、生存能力、发育时间、男性贡献和成年寿命。测量翅膀长度和面积也被选为健身测量，因为它与胸部长度^18,19 和体型测量相关，后者与血粉大小、繁殖力和免疫力直接相关^20,21。尽管有许多方法可以评估健康状况，但之所以选择这些参数，是因为它们反映了生殖成功率，易于测量，并且通常在文献中报道。

研究方案

注意:该协议是为先前已经过验证和建立的转基因和野生型 埃及 Aérpenti 品系编写的。有关生成 转基因埃及伊蚊的更多信息，请参阅Kistler 等人。²² 和 Coates 等人。²³. 下文概述的所有实验均在标准的 埃及伊蚊 饲养程序下进行。蚊子保持在28°C，相对湿度为75%-80%，光照周期为12小时/黑暗周期为12小时。出于统计目的，强烈建议每种蚊子污渍至少使用 100 个单独的蛋纸。全面的体能研究大约需要 3 个月才能完成（图 1）。

1. 测量雌性蚊子的繁殖力

1. 按照标准饲养条件，将卵纸放入昆虫的无菌水中过夜，孵化转基因蚊子和WT蚊子（具有相同的遗传背景，但缺乏转基因）。通过提供几滴（每滴约 50 μL）磨碎的鱼食 （Tetramin） 浆液（约 30% w/v），让幼虫 随意 进食。一龄幼虫在孵化后 1 天可识别。将幼虫放入较大的容器中，以免拥挤，通常可以在1升体积的水中饲养100-150只幼虫，表面积约为250厘米²。继续提供 Tetramin 浆液作为食物来源，让幼虫 随意进食。将食物浆液加入离散的液滴中，以便幼虫始终获得足够的食物，并且水不会显得浑浊。幼虫的大小会随着每龄的增加而增加，并最终在幼虫盘中化蛹。
2. 一旦蛹开始出现，在孵化后~5-6天，按性别将它们分开，以确保成虫一旦出现就是处女（用于随后的交配），如下所述。
   1. 要按性别对蛹进行分类，首先使用 3 mL 塑料移液器将蛹取出蛹，放入装有干净自来水的小塑料杯中。与雌性相比，雄性蛹往往较小，并且往往首先出现。首先，按大小对蛹进行分类，然后通过形态确认这个初始筛选。
   2. 将蛹移至玻璃显微镜载玻片上，并用组织去除多余的水。这使蛹无法动弹。在 2x-4x 放大倍率的立体镜下，使用细尖画笔将蛹腹侧朝上放置。
   3. 目视分析尾巴生殖叶形状的差异（在蛹腹节的末端，桨后面; 图2）。雌性有尖头的鳍，延伸到生殖叶之外，大致类似于皇冠或吸血鬼的牙齿，而男性的生殖叶是圆形的，没有这些尖头结构。参见Carvalho et al.²⁴ 为补充数字。
3. 将雄性和雌性蛹放在单独的水杯中，并将它们置于适当的容器中，例如ample，1.9 升纸箱（1/2 加仑或 64 盎司）和 0.2 m x 0.2 m（8 英寸 x 8 英寸）白色有机织物，每个包含 ~150 个蛹。
4. 在笼子的顶部提供糖和水源（例如，葡萄干和一个用纱布覆盖的装满水的杯子，用两根橡皮筋固定）。在纸箱上切一个笔大小的孔，并用橡胶塞盖住它，以便在笼子出现时可以将更多的蛹添加到笼子中。
5. 在成虫出苗后3-5天，通过将纸箱置于4°C~2-5分钟来麻醉蚊子。虽然蚊子可能仍然会抽搐，但一旦大多数蚊子掉到纸箱底部，蚊子就会得到充分的麻醉。将蚊子放在冰上的玻璃培养皿上~30分钟-1小时。
   注意:将蚊子置于4°C下太久可能会严重影响它们的健康，尽管我们没有发现如果它们放在冰上长达1小时会产生任何影响。
6. 通过将麻醉蚊子以 5 只 WT 或转基因雄性与 1 只 WT 雌性（含 1 只 WT 或转基因雌性）的比例加入蚊子箱中，将 WT 或转基因 GD1 或 GD2⁹（基于 CRISPR/Cas-9 的基因驱动）雄性与原始 WT（对照）雌性 大量 加入蚊子箱中，每个蚊子含有 ~150 只蚊子。确保按公类型标记笼子。
   注意:该杂交方案用于确定 GD1 或 GD2⁹ 个半合子（即携带一个转基因拷贝的蚊子）的适用性。为了确定纯合转基因系的适宜性，可以调整杂交方案，以便与WT雄性和雌性的杂交相比，允许转基因雄性和雌配。
7. 2-3 天后，按照标准饲养实践²⁵ 通过在笼子顶部提供血源来喂养雌性。在采血前24 h去除糖源，在采血前~2-3 h去除水源，以提高采血效率。
8. 血液喂养后，通过将蚊子置于4°C来麻醉蚊子，如步骤1.5所示。
9. 通过目视筛查腹部是否有肿胀，将血液喂养（完全充血）的女性与未喂养的女性进行分类。丢弃未进食的、部分进食的和雄性的。
10. 将充血的雌性放回各自的笼子中，并在笼子顶部提供糖和水源。
11. 2-3 天后，将单个雌性放入 50 mL 锥形管中，内衬有用铅笔预先标记的滤纸（图 3）。用网眼覆盖锥形管，并用两根橡皮筋密封。
12. 一旦雌性醒来，用 ~5 mL 自来水填充所有管子。将一小块葡萄干或糖浸泡的棉球放在每个锥形管的顶部。将雌性留在昆虫中 1-2 天，让它们产卵。
13. 1-2天后，排干每个锥形管，并通过将它们置于4°C来麻醉蚊子。 为了快速处理，使用压在网眼上的 3 mL 塑料移液器的尖端排出每个锥形管中的水。将管子倒置，然后将它们放在纸巾上以排空。将50mL锥形管置于管架中，并将架子置于4°C。
14. 收集蛋纸，计算每张纸上的蛋数量。将不产卵的雌性计为 0，并将它们包含在分析中。计算平均繁殖力，即每张纸上计算的卵总数除以筛选的雌性总数。
    注意:单个蛋纸的数字图片可作为计数确认的视觉记录（图 4）。
15. 将蛋纸晾干，然后将它们放回昆虫中。建议蛋纸干燥至少 3-5 天，以获得最佳孵化²⁵.

2. 测量机翼长度、面积和质心尺寸

1. 通过将蚊子笼置于-20°C约15分钟，从已完成的繁殖力研究中冷冻至少25 WT或转基因年龄匹配的血液喂养的雌性。
   注意:不要长时间冷冻，也不要摇晃或掉落容器，因为这可能会导致鸡翅从蚊子身上掉落。
2. 解剖每只蚊子的左翼，在翅膀和胸部的关节处切除，按照以下方案切除整个翅膀。
   1. 一只手用镊子握住蚊子，抓住翅膀下方的胸部区域。
   2. 另一只手用另一把镊子解剖每只蚊子的左翼，在翅膀和胸部的关节处切除，轻轻按压将翅膀拉下，在不撕裂翅膀静脉的情况下去除整个翅膀。
3. 使用镊子将机翼放在载玻片上，平放。使用移液管，从 15 mL 储备溶液（由 70% 乙醇组成）中加入一滴和一滴洗洁精到载玻片上的翅膀上。
4. 将一滴 80% 甘油加入盖玻片中，然后放在机翼顶部的乙醇肥皂溶液中。
5. 使用配备 65 mm 镜头的相机拍摄安装在载玻片上的机翼（7D-65 mm-1x;变焦 = 1、200、6.3、ISO = 100）。请注意像素/毫米刻度，并确保所有图像的像素/毫米刻度保持不变。如果将多个机翼成像在一起，请将照片裁剪为单个机翼，并为每张照片添加比例尺。使用LZW压缩将图像保存为TIFF格式，每个图像都清楚地标有各个机翼的所有信息。
   注意:如果设置保持不变并且研究中每个拍摄的机翼的像素/毫米刻度保持不变，则可以使用不同的相机和放大倍率或使用连接到显微镜的相机进行其他研究来拍摄机翼。在确定测量值时，将考虑像素/毫米比率。
6. 下载 tpsUtil 和 tpsDig，它们是免费的形态测量图像处理软件。有关软件的更多详细信息，请参见 Rohlf^26,27。
7. 使用 tpsUtil 对机翼进行数字化，以创建机翼照片的 TPS 文件，以便进行下一步的数字化。
   1. 为此，请打开 tpsUtil，然后在 操作下选择" 从图像构建 tps 文件"。单击 "输入"，选择包含各个机翼图像的文件，然后选择任何图像以选择此文件夹。单击 "输出 "，然后命名将以 .tps 格式创建的文件。点击 保存。
   2. 然后，在 "操作"下，单击" 设置"。选择" 全部包含"，单击" 创建 "并关闭弹出框。在 操作下，现在选择 随机订购标本。单击 输入 并选择刚刚创建的 .tps 文件。单击 "输出"，重命名 .tps 文件以指示这是随机化样本的文件版本，然后单击" 保存"。然后，单击 "创建"。关闭 tpsUtil 程序。
      注意: 为减少测量误差，机翼照片可能会被复制并使用两次进行技术复制。
8. 使用 tpsDig 软件识别地标的二维笛卡尔坐标。在 "输入"下，选择在步骤 2.7 中创建的 .tps 文件。将刻度设置为步骤2.5确定的刻度;在 "选项"下，选择" 图像工具"，然后单击" 度量"。
9. 通过单击表示数字化地标的蓝色十字准线图标向图像添加地标，然后单击 图 5 中指示的机翼关节，按从地标 1 到地标 14 的顺序排列。
   注:之所以选择这些标志，是因为它们以前曾用于机翼标志数字化和分析¹⁹，很容易在许多样品的机翼静脉关节处找到，并提供足够的机翼标志来捕获机翼的大小和形状。
10. 在标记地标时，通过单击 M 图标在 tpsDig 中将任何缺失或遮挡的地标（由于机翼折叠或损坏）标记为缺失，以将它们从分析中排除并保留地标的正确顺序。单击红色的右向箭头，对下一个图像重复具有里程碑意义的数字化，直到文件中的所有图像都完成。保存并关闭文件。
    注意:必须按照每个图像的正确顺序将地标添加到机翼图像中，才能正确计算机翼长度、面积和大小。
11. 使用 补充文件 1 中提供的 R 脚本计算机翼长度和面积，并根据实验修改 .tps 文件位置和图像比例。
12. 计算机翼质心尺寸，这是一种在统计上独立于形状的大小量度，定义为每个地标从机翼中心点^28,29 的平方根。
13. 使用广义的 procrustes 对齐来消除非形状变化并绘制平均地标坐标，使用所有地标完好无损的翼。对于机翼质心大小和平均地标确定，请使用 补充文件 2 中提供的 R 脚本，并根据实验修改 .tps 文件位置和图像比例。

3. 评估卵子受精率

1. 从从单个雌性收集的试纸（在步骤1中收集）中孵化单个F₁ 卵到含有~100mL新鲜灭菌去离子水的聚丙烯透明熟食容器中。加入两到三滴磨碎的鱼食 浆，随意 喂食。在容器的顶部铺上网眼或有机纤维，并用橡皮筋固定。
2. 在孵化后 2-3 天，将蛋纸从水中取出，将它们放入盖有盖子或网的新容器中，让它们干燥过夜，然后将它们留在昆虫中。
3. 将蛋纸放回水容器中，在最初孵化的同一容器中重新孵化蛋纸。
   注意:干燥和重新孵化蛋纸可大大提高孵化效率。对于其他蚊子种类，这可能不是必需的。
4. 在初次孵化后 3-5 天，目视检查幼虫（第^{2 至 4} 龄）是否有转基因标记（如果适用;图6）。在荧光显微镜下同时检查几个幼虫，方法是将它们放在一张滤纸上，该滤纸放在衬有纸巾的有机物或网状物的顶部。纸巾吸收多余的水，因此滤纸可以用来筛选和操纵固定的幼虫。
5. 记录阳性或阴性转基因幼虫的数量。丢弃阴性幼虫。
6. 清洁幼虫水，以确保最佳的发育时间。为此，将幼虫移液到一个小杯中，丢弃脏水，然后用新鲜的自来水代替 加入阳性幼虫并确保有足够的鱼粉食物浆液。
7. 生育率计算为转基因幼虫或对照幼虫的数量除以卵总数。

4.蛹中性别比例的测定

1. 孵化后最多 14 天，继续收集和记录雄性和雌性蛹的数量（如步骤 1.2.3 中所述）。根据性别，雌性或雄性可以合并到装在 1.9 升容器中的小杯子中。
2. 要确定性别比例，请将 F₁ 雌性蚊子的数量或在研究时间线上每只成年雌性蚊子收集的 F₁ 雄性数量相加。将此数字除以从单个雌性生成的同一蚊子系收集的蛹总数。

5. 幼虫存活率的测定

1. 为了确定幼虫的生存能力，将每只成年雌性蚊子在研究时间线上收集的蛹总数相加。
2. 将此数字除以步骤 3 中计算的同一行中每只成年雌性蚊子计数的幼虫总数。

6. 幼虫到蛹发育时间的测定

1. 为了确定幼虫到蛹的发育，每天跟踪幼虫的数量和每行的蛹数。
2. 将幼虫到蛹的发育计算为孵化后蛹发育的平均时间。

7. 男性缴费的确定

1. 使用年龄匹配的雄性，在冰上麻醉成年处女转基因雄性蚊子，以及成年处女雄性和雌性对照蚊子。
2. 通过将 50 个转基因或 50 个对照雄性（年龄匹配）与 100 个对照雌性加入 64 盎司纸箱中，将转基因或对照雄性与对照雌性杂交，从而总共有 50 个雄性和 100 个雌性（两个对照雌性:一个对照或转基因雄性）。确保标记哪个纸箱含有转基因雄性，哪个纸箱含有对照雄性。
3. 让交配发生 2-3 天。在这段时间之后，按照标准的饲养方法给蚊子提供血粉。
4. 血液喂养三天后，将单个完全充血的雌性分离到 50 mL 锥形管中，内衬有预先标记的白色滤纸，如步骤 1（繁殖力测定）中所述。丢弃未喂食的雌性，或在第二天给它们提供另一次血粉。用 ~5 mL 自来水填充所有管子。将一小块葡萄干放在每个锥形管顶部的网格上。
5. 将雌性留在昆虫中 1-2 天，让它们产卵。在血粉后 4-5 天内目视检查蛋纸中是否有卵子。让雌性多一天的时间产卵，以提高产卵率。
6. 为了收集卵纸，排干水并通过在4°C下放置锥形管来麻醉雌性，如前所述。将雌性蚊子放入70%乙醇中丢弃。
7. 将试纸放在昆虫管中至少 5 天晾干。使用镊子取出试纸，并将它们放入装有 ~100 mL 新鲜灭菌去离子水的聚丙烯透明熟食容器中进行孵化。加入 2-3 滴磨碎的鱼食 浆，随意 投料。用网眼或有机纤维铺在容器的顶部，并用橡皮筋固定。
8. 在孵化后 2-3 天，将蛋纸从水中取出，将它们放入盖有盖子或网的新容器中，让它们晾干一夜，然后将它们放回昆虫中。
9. 将蛋纸放回水容器中，在相同的容器中重新孵化蛋纸。
10. 在初次孵化后 3-5 天，目视检查幼虫（^第 2 至 4 龄）是否有转基因标记（如果适用）。计算雄性贡献为F₂转基因幼虫的数量除以每株蚊子品系的总幼虫数量。

8. 蚊子寿命的测定

1. 将 50 只雄性和 50 只雌性 WT 或转基因年龄匹配的非血饲蚊子转移到适当的围栏中。使用 64 盎司的纸箱，顶部开口衬有连裤袜，扭曲并打结关闭，以便在实验过程中轻松接触和操作蚊子（图 7）。
   注意:出于统计目的，建议一式三份进行。
2. 提供糖和水源。在这里，使用了葡萄干和一个衬有纱布的装满水的杯子，用两根橡皮筋固定。
3. 追踪每天死亡的雄性和雌性蚊子数量。计算寿命为蚊子在笼子中死亡之前经过的平均天数，省略因非信息性原因死亡的蚊子（不是由于蚊子寿命的原因，例如被压扁或淹死在糖中）并省略在研究结束时仍然活着的蚊子。
   注意:生存定义为在时间 t 之前存活的概率，或函数 S（t） = Pr（T>t）。中位生存率是生存概率为 0.5 的时间，即 T_0.5 = ^S-1 x 0.5。

结果

按照上述方案，评估了两种蚊子系的适应性:（1） CRISPR/Cas9 介导的 Aétre 敲除 Ae. aegypti D7L1 （AAEL006424） 唾液蛋白和 （2） 表达自主 CRISPR/Cas9 介导的基因驱动的 Ae. aegypti 系⁹.在前者的情况下，通过利用非同源末端连接途径 （NHEJ） 建立纯合 D7L1 敲除系，在显微注射具有 D7L1 基因特异性的 sgRNA 胚胎后产生破坏。杂合子 D7L1-KO 蚊子回交到 WT 四代，然后产生稳定的...

讨论

埃及适应性研究通常在实验室中进行，以评估与转基因货物（例如，基因驱动元件）或基因敲除相关的适应性成本，如本手稿中所讨论的;然而，这些研究可以用于各种目的——任何旨在评估埃及伊蚊组健康状况的研究，例如感染沃尔巴克氏体的^30,31、抗杀虫剂的^32,33 或感染虫媒病毒...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.