Quantification des coûts de la condition physique chez les moustiques transgéniques Aedes aegypti

Résumé

Le présent protocole décrit comment mesurer les données des paramètres de vie communs chez les moustiques Aedes aegypti , y compris la fécondité, la taille des ailes, la fertilité, le rapport des sexes, la viabilité, les temps de développement, la contribution des mâles et la longévité des adultes. Ces mesures peuvent être utilisées pour évaluer la valeur adaptative des moustiques transgéniques.

Résumé

Les moustiques transgéniques présentent souvent des coûts de forme physique par rapport à leurs homologues de type sauvage. À cet égard, les études sur les coûts de la condition physique consistent à collecter des données sur les paramètres de vie des moustiques génétiquement modifiés et à les comparer à des moustiques dépourvus de transgènes du même patrimoine génétique. Ce manuscrit illustre comment mesurer les traits communs de l’histoire de vie du moustique Aedes aegypti, notamment la fécondité, la taille et la forme des ailes, la fertilité, le rapport des sexes, la viabilité, les temps de développement, la contribution des mâles et la longévité des adultes. Ces paramètres ont été choisis parce qu’ils reflètent le succès de reproduction, qu’ils sont simples à mesurer et qu’ils sont couramment rapportés dans la littérature. Les résultats représentatifs quantifient les coûts de fitness associés à l’inactivation d’un gène ou à l’insertion unique d’un élément de forçage génétique. Il est important de normaliser la façon dont les données sur les paramètres de vie sont collectées, car ces données peuvent être utilisées pour comparer la santé des moustiques transgéniques générés dans les études ou pour modéliser le taux de fixation des transgènes dans une population de moustiques de type sauvage simulée. Bien que ce protocole soit spécifique à Aedes aegypti transgénique, il peut également être utilisé pour d’autres espèces de moustiques ou d’autres conditions de traitement expérimental, avec la mise en garde que certains contextes biologiques peuvent nécessiter des adaptations spéciales.

Introduction

La survie du plus apte est l’idée darwinienne selon laquelle les individus qui hébergent les gènes les mieux adaptés à leur environnement transmettront ces gènes aux générations suivantes¹. Cela signifie que c’est la forme physique qui détermine si leurs gènes survivront. Ce concept vieux de plus de 150 ans est peut-être le déterminant le plus important de l’ingénierie d’un forçage génétique réussi chez les moustiques transgéniques. Le forçage génétique, ou le mode d’hérédité super-mendélien d’un élément génétique égoïste qui lui permet de se propager dans les populations², est à l’étude pour la lutte génétique contre les ravageurs³. Dans le cadre de la lutte antivectorielle, cette stratégie vise soit à remplacer les arthropodes de type sauvage (WT) par des arthropodes résistants aux pathogènes (modification de la population), soit à les éliminer complètement (suppression de la population⁾⁴. Cependant, les moustiques transgéniques présentent souvent des coûts de fitness (également appelés charge génétique) par rapport à leurs homologues WT, ce qui signifie que le transgène sera perdu dans les populations qui peuvent les surpasser. Le couplage des transgènes avec un système de forçage génétique est donc nécessaire pour compenser les coûts de fitness et pousser le transgène à travers la population à des niveaux plus élevés que prévu à partir de l’héritage mendélien typique⁴.

Des études en laboratoire sur les espèces de moustiques vecteurs ont montré que les transgènes présentent souvent des coûts de fitness ^5,6,7. Par exemple, Irvin et al. mesuré divers paramètres de vie chez Aedes (Ae.) aegypti modifié pour exprimer des gènes de protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) ou de transposase sous l’actine 5C de la drosophile ou des promoteurs synthétiques 3XP3, et les a comparés à la souche de type sauvage Orlando (le même patrimoine génétique dont ils sont dérivés)⁵. Plus particulièrement, ils ont constaté que toutes les souches transgéniques avaient une capacité de reproduction significativement réduite⁵. En fonction du transgène, certains moustiques anophèles (An.) exprimant des transgènes qui inhibent le développement du parasite Plasmodium ont également présenté des coûts de fitness⁶. Plus précisément, An. stephensi exprimant une phospholipase de venin d’abeille (PLA2) sous des promoteurs constitutifs ou induits par la farine de sang a pondu significativement moins d’œufs que les témoins⁶. Ces auteurs ont également constaté que les anophèles transgéniques exprimant un transgène différent, un tétramère de dodécapeptide SM1, ne présentaient pas de coûts de valeur adaptative, ce qui les a amenés à conclure que les coûts de valeur adaptative conférés par les transgènes dépendent, du moins probablement en partie, de l’effet de la protéine transgénique produite⁶. En effet, les coûts de la valeur adaptative peuvent être attribués aux produits transgéniques, aux effets de position, aux effets hors cible, à la mutagenèse insertionnelle ou aux effets de consanguinité dans les souches élevées en laboratoire⁷. Le forçage génétique doit donc être suffisamment robuste pour compenser ces coûts de fitness induits par les transgènes tout en évitant le développement d’insertions et de délétions (indels) qui bloquent le moteur lui-même.

Les coûts de la capacité de développement ou de reproduction peuvent être mesurés dans des études en laboratoire ou en cage⁷, avec une mise en garde étant que des facteurs inconnus sur le terrain peuvent également avoir un impact. Néanmoins, les études contrôlées de la condition physique constituent une première étape importante lors de la planification ou de l’évaluation des lâchers de moustiques génétiquement modifiés, comme un programme de forçage génétique, afin de déterminer si la lignée transgénique persistera au cours des générations suivantes. Par exemple, Hammond et al. évalué Un forçage génétique basé sur CRISPR/Cas9 destiné à perturber les gènes nécessaires à la fertilité féminine⁸. Grâce à des études en cage maintenues pendant au moins 25 générations, les auteurs ont découvert que les moustiques contractaient des allèles résistants au forçage génétique qui bloquaient le clivage ciblé par CRISPR et restauraient la fertilité féminine⁸. Leurs efforts de modélisation ont suggéré que la fertilité chez les femelles hétérozygotes pour le forçage génétique avait les impacts les plus spectaculaires sur la fixation du forçage génétique dans des conditions simulées⁸. Dans le même ordre d’idées, Ae. aegypti (souche de l’œil blanc de Higgs, HWE) conçue pour exprimer des cassettes de forçage génétique autonomes sous différents promoteurs ou à différents loci intergéniques a montré différents taux de fixation du forçage génétique dans des populations simulées⁹. À l’aide de la modélisation MGDrivE¹⁰, combinée aux taux mesurés de formation d’indel, aux effets maternels et aux données de paramètres de vie collectées en laboratoire, les auteurs ont constaté que la valeur adaptative des moustiques influençait le plus fortement la persistance du forçage génétique dans des conditions simulées⁹. Les coûts de fitness qui sont les plus susceptibles d’altérer l’efficacité du forçage génétique sont attribuables à la (sur-expression) somatique de Cas9 ou au gène ciblé, en particulier chez les hétérozygotes, plutôt qu’à l’entraînement intrinsèque lui-même 11,12,13,14,15,16,17.

Compte tenu de son importance, la valeur adaptative est un facteur important de la capacité d’une lignée transgénique à persister au cours des générations suivantes, et elle peut être utilisée comme indicateur de tout effet physiologique associé à un transgène. Par exemple, des effets hors cible peuvent être associés aux coûts de fitness. Dans ce cas, il est recommandé de rétrocroiser une lignée transgénique sur plusieurs générations. De plus, il peut également être nécessaire de croiser la ligne transgénique avec une ligne qui reflète une population de terrain pour déterminer dans quelle mesure la population transgénique peut rivaliser dans le monde réel. Pour quantifier les coûts de fitness afin qu’ils puissent être comparables, ce manuscrit fournit des protocoles simples pour mesurer les traits courants de l’histoire de vie des moustiques Ae. aegypti, avec un accent particulier sur les coûts de fitness associés aux transgènes, afin que de telles études puissent être reproduites plus facilement. Les protocoles comprennent la fécondité, la fertilité, le rapport des sexes, la viabilité, les temps de développement, la contribution des mâles et la longévité à l’âge adulte. La mesure de la longueur et de la surface des ailes a également été choisie comme mesure de la condition physique, car elle correspond à la longueur du thorax^18,19 et aux mesures de la taille du corps, qui est directement liée à la taille du repas de sang, à la fécondité et à l’immunité^20,21. Bien qu’il existe de nombreuses façons d’évaluer la valeur adaptative, ces paramètres ont été choisis parce qu’ils reflètent le succès de la reproduction, qu’ils sont simples à mesurer et qu’ils sont couramment rapportés dans la littérature.

Protocole

REMARQUE : Ce protocole est rédigé pour les lignées transgéniques et de type sauvage Ae. aegypti qui ont déjà été validées et établies. Pour plus d’informations sur la génération d’Ae. aegypti transgéniques, voir Kistler et al.²² et Coates et al.²³. Toutes les expériences décrites ci-dessous ont été réalisées selon les procédures d’élevage standard d’Ae. aegypti . Les moustiques ont été maintenus à 28 °C avec une humidité relative de 75 % à 80 % et un cycle de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité. Un minimum de 100 papiers d’œufs individuels par tache de moustique est fortement recommandé à des fins statistiques. Les études complètes de condition physique durent environ 3 mois (figure 1).

1. Mesurer la fécondité chez les moustiques femelles

1. Faites éclore des moustiques transgéniques et WT (du même patrimoine génétique mais dépourvus du transgène) en plaçant des feuilles d’œufs dans de l’eau stérile pendant la nuit dans l’insectarium, en suivant les conditions d’élevage standard. Laisser les larves se nourrir à volonté en leur fournissant plusieurs gouttes (environ 50 μL chacune) de boue de nourriture pour poissons de fond (Tetramin) (environ 30 % p/v). Les larves du premier stade sont reconnaissables 1 jour après l’éclosion. Placez les larves dans des récipients plus grands afin qu’il n’y ait pas d’encombrement, généralement 100 à 150 larves peuvent être élevées dans un volume d’eau de 1 L avec une surface d’environ 250 cm². Continuer à fournir du lisier Tetramin comme source de nourriture, permettant aux larves de se nourrir à volonté. Ajoutez la bouillie alimentaire en gouttelettes discrètes afin que les larves aient toujours suffisamment de nourriture à leur disposition et que l’eau n’apparaisse pas trouble. Les larves augmenteront en taille à chaque stade et entreront finalement en nymphose dans les bassins larvaires.
2. Une fois que les pupes commencent à émerger, ~5-6 jours après l’éclosion, séparez-les par sexe pour vous assurer que les adultes sont vierges une fois qu’ils émergent (pour un accouplement ultérieur), comme décrit ci-dessous.
   1. Pour trier les pupes par sexe, commencez par les cueillir à l’aide de pipettes en plastique de 3 ml dans de petits gobelets en plastique contenant de l’eau du robinet propre. Les pupes mâles ont tendance à être plus petites et ont tendance à émerger en premier par rapport aux femelles. Tout d’abord, triez les pupes par taille, puis validez ce premier dépistage par morphologie.
   2. Déplacez la chrysalide sur une lame de microscope en verre et retirez l’excès d’eau avec un mouchoir. Cela immobilise la nymphe. Sous un stéréoscope à grossissement de 2x-4x, positionnez la nymphe face ventrale vers le haut à l’aide d’un pinceau à pointe fine.
   3. Analysez visuellement la queue pour détecter des différences dans la forme du lobe génital (à l’extrémité des segments abdominaux de la nymphe derrière les pagaies ; Figure 2). Les femelles ont des nageoires pointues qui s’étendent au-delà des lobes génitaux, ressemblant à peu près à une couronne ou à des dents de vampire, tandis que les lobes génitaux des mâles sont arrondis et n’ont pas ces structures pointues. Voir Carvalho et al.²⁴ pour des chiffres supplémentaires.
3. Placez les pupes mâles et femelles dans des gobelets d’eau séparés et placez-les dans un confinement approprié, par exemple, des cartons de 1,9 L (1/2 gallon ou 64 oz) avec 0,2 m x 0,2 m (8 po x 8 po) de tissu organdi blanc, chacun contenant ~150 nymphes.
4. Fournissez une source de sucre et d’eau sur le dessus des cages (par exemple, des raisins secs et une tasse remplie d’eau recouverte de gaze, fixée par deux élastiques). Découpez un trou de la taille d’un stylo dans les cartons et couvrez-le d’un bouchon en caoutchouc afin que des pupes supplémentaires puissent être ajoutées dans les cages au fur et à mesure qu’elles émergent.
5. De 3 à 5 jours après l’émergence des adultes, anesthésier les moustiques en plaçant les cartons à 4 °C pendant ~2 à 5 min. Bien qu’ils puissent encore se contracter, les moustiques sont suffisamment anesthésiés une fois que la majorité d’entre eux tombent au fond du carton. Placez les moustiques sur une boîte de Pétri en verre sur de la glace pendant ~30 min-1 h.
   REMARQUE : Laisser les moustiques à 4 °C pendant trop longtemps peut avoir un impact significatif sur leur santé, bien que nous n’ayons trouvé aucun impact s’ils sont laissés sur la glace jusqu’à 1 h.
6. Croisez en masse des mâles WT ou transgéniques GD1 ou GD2⁹ (forçage génétique basé sur CRISPR/Cas-9) avec des femelles WT vierges (témoins) en ajoutant des moustiques anesthésiés dans des proportions de cinq mâles WT ou transgéniques pour une femelle WT dans des boîtes à moustiques, chacune contenant ~150 moustiques. Assurez-vous d’étiqueter les cages par type de mâle.
   REMARQUE : Ce schéma de croisement vise à déterminer la valeur adaptative des hémizygotes GD1 ou GD2⁹ (c’est-à-dire les moustiques hébergeant une copie du transgène). Pour déterminer la valeur adaptative des lignées transgéniques homozygotes, le schéma de croisement peut être adapté de sorte que les mâles et les femelles transgéniques soient autorisés à s’accoupler par rapport aux croisements de mâles et de femelles WT.
7. Après 2-3 jours, nourrissez les femelles avec du sang en suivant les pratiques d’élevage standard²⁵ en fournissant une source de sang sur le dessus de la cage. Retirez la source de sucre 24 h avant l’alimentation par le sang et la source d’eau ~2-3 h avant l’alimentation par le sang pour augmenter l’efficacité de l’alimentation.
8. Après l’alimentation par le sang, anesthésiez les moustiques en les plaçant à 4 °C, comme à l’étape 1.5.
9. Triez les femelles nourries de sang (complètement engorgées) des femelles non nourries en dépistant visuellement leur abdomen pour détecter l’engorgement. Jetez les non-nourris, les partiellement nourris et les mâles.
10. Remettez les femelles engorgées dans leurs cages respectives et fournissez une source de sucre et d’eau sur le dessus des cages.
11. Après 2 à 3 jours, placez les femelles dans des tubes coniques de 50 ml tapissés de papier filtre pré-étiqueté au crayon (figure 3). Couvrez les tubes coniques avec un treillis et scellez avec deux élastiques.
12. Une fois que les femelles sont réveillées, remplissez tous les tubes avec ~5 mL d’eau du robinet. Placez un petit morceau de raisin sec ou de boule de coton imbibée de sucre sur chaque tube conique. Laissez les femelles pendant 1 à 2 jours dans l’insectarium et laissez-les pondre.
13. Après 1 à 2 jours, égouttez chaque tube conique et anesthésiez les moustiques en les plaçant à 4 °C. Pour un traitement rapide, utilisez l’embout d’une pipette en plastique de 3 ml pressée contre le grillage pour drainer l’eau de chaque tube conique. Retournez les tubes et placez-les sur une serviette en papier pour les égoutter. Placez les tubes coniques de 50 ml dans un support de tube et placez la grille à 4 °C.
14. Récupérez le papier à œufs et comptez le nombre d’œufs sur chaque papier. Comptez les femelles qui ne pondent pas d’œufs jusqu’à 0 et incluez-les dans l’analyse. Calculez la fécondité moyenne en divisant le nombre total d’œufs comptés sur chaque papier par le nombre total de femelles dépistées.
    REMARQUE : Les images numériques des feuilles d’œufs individuelles peuvent servir d’enregistrement visuel pour la confirmation du comptage (figure 4).
15. Séchez les feuilles d’œufs et remettez-les dans l’insectifuge. Il est recommandé de faire sécher les papiers d’œufs pendant au moins 3 à 5 jours pour une éclosion optimale²⁵.

2. Mesure de la longueur, de la surface et de la taille du centroïde de l’aile

1. Congeler au moins 25 femelles WT ou transgéniques nourries au sang de l’étude de fécondité terminée en plaçant les cages à moustiques à -20 °C pendant environ 15 minutes.
   REMARQUE : Ne congelez pas pendant une période plus longue et ne secouez pas ou ne laissez pas tomber le récipient, car cela pourrait faire tomber les ailes des moustiques.
2. Disséquez l’aile gauche de chaque moustique, en excisant l’articulation de l’aile et du thorax, en enlevant l’intégralité de l’aile, en suivant le protocole ci-dessous.
   1. D’une main, tenez le moustique avec une pince, en saisissant la région du thorax sous les ailes.
   2. À l’aide d’une autre paire de pinces dans l’autre main, disséquez l’aile gauche de chaque moustique, en excisant l’articulation de l’aile et le thorax en expulsant doucement l’aile, en retirant la totalité de l’aile sans déchirer les veines de l’aile.
3. À l’aide d’une pince, placez l’aile sur une lame de verre, à plat. À l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez une goutte d’une solution mère de 15 mL, composée à 70 % d’éthanol, et une goutte de savon à vaisselle dans l’aile de la lame.
4. Ajoutez une goutte de glycérol à 80 % dans la lamelle et placez-la sur le dessus de l’aile dans la solution d’éthanol-savon.
5. Photographiez les ailes montées sur les diapositives à l’aide d’un appareil photo équipé d’un objectif de 65 mm (7D-65 mm-1x ; zoom = 1, 200, 6,3, ISO = 100). Notez l’échelle pixel/mm et assurez-vous qu’elle reste la même pour toutes les images. Si plusieurs ailes sont imagées ensemble, recadrez les photos sur des ailes individuelles et ajoutez des barres d’échelle à chaque photo. Enregistrez les images au format TIFF avec compression LZW, chaque image étant clairement étiquetée avec toutes les informations relatives à chaque aile.
   REMARQUE : Les ailes peuvent être photographiées à l’aide d’un appareil photo et d’un grossissement différents ou avec un appareil photo fixé à un microscope pour d’autres études, si les paramètres restent les mêmes et que l’échelle pixel/mm reste la même pour chaque aile photographiée dans l’étude. Le rapport pixel/mm sera pris en compte lors de la détermination des mesures.
6. Téléchargez tpsUtil et tpsDig, qui sont des logiciels gratuits de traitement d’images morphométriques. Voir Rohlf ^26,27 pour plus d’informations sur le logiciel.
7. Numérisez les ailes à l’aide de tpsUtil pour créer un fichier TPS des photographies des ailes pour la prochaine étape de numérisation.
   1. Pour ce faire, ouvrez tpsUtil et, sous Opération, sélectionnez Générer un fichier tps à partir d’images. Cliquez sur entrée, sélectionnez le fichier contenant les images individuelles de l’aile, puis sélectionnez n’importe quelle image pour choisir ce dossier. Cliquez sur sortie et nommez le fichier qui sera créé au format .tps. Cliquez sur Enregistrer.
   2. Ensuite, sous actions, cliquez sur configurer. Sélectionnez Tout inclure, cliquez sur Créer et fermez la fenêtre contextuelle. Sous Opération, sélectionnez maintenant Ordonner les échantillons de manière aléatoire. Cliquez sur entrée et sélectionnez le fichier .tps qui vient d’être créé. Cliquez sur sortie, renommez le fichier .tps pour indiquer qu’il s’agit de la version du fichier avec les échantillons aléatoires, puis cliquez sur Enregistrer. Cliquez ensuite sur Créer. Fermez le programme tpsUtil.
      REMARQUE : Pour réduire les erreurs de mesure, les photos de l’aile peuvent être dupliquées et utilisées deux fois pour une réplique technique.
8. Utilisez le logiciel tpsDig pour identifier les coordonnées cartésiennes bidimensionnelles des points de repère. Sous Entrée, sélectionnez le fichier .tps créé à l’étape 2.7. Réglez l’échelle à l’échelle déterminée à l’étape 2.5 ; Sous Options, sélectionnez Outils d’image, puis cliquez sur Mesurer.
9. Ajoutez des points de repère à l’image en cliquant sur l’icône en forme de réticule bleu représentant les points de repère de numérisation, puis cliquez sur les articulations de l’aile indiquées à la figure 5, dans l’ordre du point de repère 1 au point de repère 14.
   REMARQUE : Ces points de repère ont été choisis parce qu’ils ont déjà été utilisés dans la numérisation et l’analyse des points de repère de l’aile¹⁹, qu’ils sont faciles à localiser au niveau des articulations des veines de l’aile sur de nombreux échantillons et qu’ils fournissent suffisamment de points de repère pour saisir la taille et la forme de l’aile.
10. Lorsque vous marquez des points de repère, marquez tous les points de repère manquants ou masqués (en raison du pliage de l’aile ou de dommages) comme manquants dans tpsDig en cliquant sur l’icône M pour les exclure de l’analyse et conserver l’ordre correct des points de repère. Cliquez sur la flèche rouge orientée vers la droite pour répéter la numérisation du point de repère pour les images suivantes jusqu’à ce que toutes les images du fichier soient terminées. Enregistrez et fermez le fichier.
    REMARQUE : Les points de repère doivent être ajoutés à l’image de l’aile dans l’ordre correct pour que les calculs de la longueur, de la surface et de la taille de l’aile soient corrects.
11. Calculez la longueur et la surface de l’aile à l’aide du script R fourni dans le fichier supplémentaire 1, en modifiant l’emplacement du fichier .tps et l’échelle de l’image selon l’expérience.
12. Calculez la taille du centroïde de l’aile, une mesure de la taille statistiquement indépendante de la forme, définie comme la racine carrée de la somme des distances au carré de chacun des points de repère à partir du point central de l’aile^28,29.
13. Utilisez un alignement généralisé de Procuste pour supprimer les variations non liées à la forme et tracez les coordonnées moyennes des points de repère, en utilisant des ailes dont tous les points de repère sont intacts. Pour déterminer la taille du centroïde de l’aile et le point de repère moyen, utilisez le script R fourni dans le fichier supplémentaire 2, en modifiant l’emplacement du fichier .tps et l’échelle de l’image selon l’expérience.

3. Évaluation de la fertilité des ovules

1. Faire éclore des œufs individuels F₁ des feuilles prélevées sur des femelles individuelles (prélevés à l’étape 1) dans des contenants de charcuterie transparents en polypropylène contenant ~100 mL d’eau déminéralisée fraîchement stérilisée. Ajoutez deux ou trois gouttes de bouillie de nourriture pour poisson haché pour l’alimentation à volonté . Tapissez le dessus des récipients avec de la maille ou de l’organdi et fixez-le avec un élastique.
2. 2-3 jours après l’éclosion, retirez les papiers d’œufs de l’eau et laissez-les sécher pendant la nuit en les plaçant dans un nouveau récipient recouvert d’un couvercle ou d’un filet et en les laissant dans l’insectarium.
3. Faites éclore à nouveau les feuilles d’œufs dans les mêmes récipients dans lesquels elles ont été initialement écloses en les replaçant dans le récipient d’eau.
   REMARQUE : Le séchage et la rééclosion des papiers d’œufs améliorent considérablement l’efficacité de l’éclosion. Cela peut ne pas être nécessaire pour d’autres espèces de moustiques.
4. De 3 à 5 jours après l’éclosion initiale, inspecter visuellement les larves (du 2e^au 4e^stade) à la recherche d’un marqueur transgénique (le cas échéant ; Figure 6). Inspectez plusieurs larves au microscope fluorescent en même temps en les plaçant sur un morceau de papier filtre placé sur un organdi ou un treillis recouvert de papier absorbant. Les serviettes en papier absorbent l’excès d’eau, de sorte que le papier filtre peut être utilisé pour filtrer et manipuler les larves immobilisées.
5. Noter le nombre de larves transgéniques positives ou négatives. Jetez les larves négatives.
6. Nettoyez l’eau des larves pour assurer des temps de développement optimaux. Pour ce faire, pipetez les larves dans une petite tasse, jetez l’eau sale et remplacez-la par de l’eau fraîche du robinet. Ajoutez les larves positives et assurez-vous qu’il y a suffisamment de boue de nourriture pour poissons de fond disponible.
7. Calculez la fertilité en divisant le nombre de larves transgéniques ou témoins par le nombre total d’œufs.

4. Détermination du sex-ratio chez les pupes

1. Jusqu’à 14 jours après l’éclosion, continuez à recueillir et à consigner le nombre de pupes mâles et femelles (comme décrit à l’étape 1.2.3). Les femelles ou les mâles peuvent être regroupés, selon le sexe, dans de petites tasses logées dans des contenants de 1,9 L.
2. Pour déterminer le rapport des sexes, ajoutez le nombre de femelles F₁ ou le nombre de mâles F₁ collectés au cours de la période d’étude par moustique femelle adulte. Divisez ce nombre par le nombre total de pupes collectées pour la même lignée de moustiques générée à partir d’une seule femelle.

5. Détermination de la viabilité des larves

1. Pour déterminer la viabilité des larves, ajoutez le nombre total de pupes collectées au cours de la période d’étude par moustique femelle adulte.
2. Divisez ce nombre par le nombre total de larves comptées par moustique femelle adulte pour cette même ligne comptée à l’étape 3.

6. Détermination du temps de développement des larves aux pupes

1. Pour déterminer le développement des larves aux nymphes, suivez quotidiennement le nombre de larves et le nombre de pupes par ligne.
2. Calculez le développement des larves aux pupes comme le temps moyen avant le développement des pupes après l’éclosion.

7. Détermination de la contribution masculine

1. À l’aide de mâles du même âge, anesthésie les moustiques mâles transgéniques vierges adultes sur la glace, ainsi que les moustiques témoins mâles et femelles vierges adultes.
2. Croisez des adultes mâles transgéniques ou témoins avec des femelles adultes témoins en ajoutant 50 mâles transgéniques ou 50 mâles témoins (appariés selon l’âge) avec 100 femelles témoins dans des cartons de 64 oz, de sorte qu’il y a un total de 50 mâles avec 100 femelles (deux femelles témoins : un mâle témoin ou transgénique). Assurez-vous d’étiqueter la boîte contenant des mâles transgéniques et celle contenant des mâles témoins.
3. Laissez l’accouplement se produire pendant 2-3 jours. Après cette période, offrez aux moustiques un repas de sang selon les pratiques d’élevage habituelles.
4. Trois jours après l’alimentation par le sang, séparer les femelles complètement engorgées dans des tubes coniques de 50 mL tapissés de papier filtre blanc pré-étiqueté, comme décrit à l’étape 1 (test de fécondité). Jetez les femelles non nourries ou offrez-leur un autre repas de sang le lendemain. Remplissez tous les tubes avec ~5 mL d’eau du robinet. Placez un petit morceau de raisin sec sur le grillage placé au-dessus de chaque tube conique.
5. Laissez les femelles pendant 1 à 2 jours dans l’insectarium et laissez-les pondre. Inspectez visuellement les papiers d’œufs pendant 4 à 5 jours après le repas de sang pour les œufs. Laisser aux femelles une journée supplémentaire pour pondre afin d’augmenter les taux de ponte.
6. Pour recueillir les feuilles d’œufs, égouttez l’eau et anesthésiez les femelles en plaçant des tubes coniques à 4 °C, comme décrit précédemment. Jetez les moustiques femelles en les plaçant dans de l’éthanol à 70%.
7. Laissez sécher les papiers en tubes dans l’insectarium pendant au moins 5 jours. À l’aide d’une pince, retirez les papiers et placez-les dans des contenants de charcuterie transparents en polypropylène contenant ~100 ml d’eau déminéralisée fraîchement stérilisée pour l’éclosion. Ajoutez 2 à 3 gouttes de bouillie de nourriture pour poissons hachés pour l’alimentation à volonté . Tapissez le dessus des récipients avec de la maille ou de l’organdi, fixé avec un élastique.
8. À 2-3 jours après l’éclosion, retirez les papiers d’œufs de l’eau et laissez-les sécher pendant la nuit en les plaçant dans un nouveau récipient recouvert d’un couvercle ou d’un filet et en les replaçant dans l’insectarium.
9. Faites éclore à nouveau les feuilles d’œufs dans les mêmes récipients en les replaçant dans le récipient d’eau.
10. De 3 à 5 jours après l’éclosion initiale, inspectez visuellement les larves (du 2e^au 4e^stade) à la recherche d’un marqueur transgénique (le cas échéant). Calculez la contribution mâle en divisant le nombre de larves transgéniques F₂ par le nombre total de larves par ligne de moustique.

8. Détermination de la longévité des moustiques

1. Transférez 50 moustiques mâles et 50 femelles WT ou transgéniques non nourris au sang dans un enclos approprié. Utilisez des cartons de 64 oz, dont l’ouverture supérieure est doublée d’un collant, torsadé et noué, pour faciliter l’accès et la manipulation des moustiques au fur et à mesure que l’expérience progresse (figure 7).
   REMARQUE : Il est recommandé de le faire en trois exemplaires à des fins statistiques.
2. Prévoyez une source de sucre et d’eau. Ici, des raisins secs et une tasse remplie d’eau doublée de gaze, fixée par deux élastiques, ont été utilisés.
3. Suivez le nombre de moustiques mâles et femelles morts chaque jour. Calculez la longévité comme le nombre moyen de jours écoulés avant que les moustiques ne meurent dans les cages, en omettant les moustiques qui meurent de causes non informatives (causes non dues à la durée de vie des moustiques, comme être écrasé ou se noyer dans le sucre) et en omettant les moustiques qui sont encore en vie à la fin de l’étude.
   REMARQUE : La survie est définie comme la probabilité d’être en vie jusqu’au temps t, ou la fonction S(t) = Pr(T>t). La survie médiane est le moment où la probabilité de survie est de 0,5, soit T_0,5 = ^S-1 x 0,5.

Résultats

Conformément au protocole ci-dessus, la valeur adaptative de deux lignées de moustiques a été évaluée : (1) l’inactivation médiée par CRISPR/Cas9 de la protéine salivaire D7L1 (AAEL006424) d’Ae. aegypti et (2) les lignées d’Ae. aegypti exprimant des forçages génétiques autonomes médiés par CRISPR/Cas9⁹. Dans le cas du premier, une lignée homozygote D7L1 a été établie en exploitant la voie d’arrivée non homologue (NHEJ) pour générer la perturbation ap...

Discussion

Les études de fitness d’Ae. aegypti sont souvent réalisées en laboratoire pour évaluer les coûts de fitness associés à la cargaison transgénique (par exemple, les éléments de forçage génétique) ou aux knock-outs de gènes, comme nous l’avons vu dans le présent manuscrit ; cependant, ces études peuvent être réalisées à diverses fins, celles qui visent à évaluer la santé d’un groupe d’Ae. aegypti, comme les personnes infectées par Wolbachia

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.