Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة لإعداد جهاز قائم على منصة الروك فعال من حيث التكلفة يستخدم للحث على الحرمان من النوم في الفئران. أثبت هذا الجهاز فعاليته في إحداث اضطرابات في أنماط النوم المثبتة بتخطيط كهربية الدماغ (EEG) ، بالإضافة إلى إحداث تغييرات أيضية وجزيئية مرتبطة بالحرمان من النوم.

Abstract

يشير اضطراب إيقاع الساعة البيولوجية إلى عدم التزامن بين البيئة الخارجية أو السلوك والساعة الجزيئية الداخلية ، مما يضعف الصحة بشكل كبير. الحرمان من النوم هو أحد الأسباب الأكثر شيوعا لاضطراب إيقاع الساعة البيولوجية. تم الإبلاغ عن طرائق مختلفة (على سبيل المثال ، المنصات على الماء ، والمناولة اللطيفة ، وغرف القضبان المنزلقة ، والطبول الدوارة ، والهزازات المدارية ، وما إلى ذلك) للحث على الحرمان من النوم في الفئران للتحقيق في آثاره على الصحة. تقدم الدراسة الحالية طريقة بديلة للحرمان من النوم في الفئران. تم تصميم جهاز آلي قائم على منصة الروك وهو فعال من حيث التكلفة ويعطل النوم بكفاءة في الفئران الجماعية على فترات زمنية قابلة للتعديل. يحفز هذا الجهاز تغييرات مميزة للحرمان من النوم مع الحد الأدنى من الاستجابة للإجهاد. وبالتالي ، قد تكون هذه الطريقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة الآثار والآليات الأساسية للحرمان من النوم على التسبب في أمراض متعددة. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر حلا فعالا من حيث التكلفة ، لا سيما عندما تكون هناك حاجة إلى تشغيل أجهزة متعددة للحرمان من النوم بالتوازي.

Introduction

يشير اضطراب إيقاع الساعة البيولوجية إلى عدم التزامن بين البيئة الخارجية أو السلوك والساعة البيولوجية الداخلية. أحد الأسباب الأكثر شيوعا لاضطراب إيقاع الساعة البيولوجية هو الحرمان من النوم1. لا يؤثر الحرمان من النوم سلبا على صحة الإنسان فحسب ، بل يزيد أيضا بشكل كبير من خطر الإصابة بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان2 وأمراض القلب والأوعية الدموية3. ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء الآثار الضارة للحرمان من النوم لا تزال غير معروفة إلى حد كبير ، وإنشاء نماذج للحرمان من النوم أمر ضروري لتعزيز فهمنا في هذا الصدد.

تم الإبلاغ عن طرق مختلفة للحرمان من النوم في الفئران ، مثل استخدام منصات المياه4 ، والمناولة اللطيفة5 ، وغرف القضبان المنزلقة6 ، والطبول الدوارة7 ، وبروتوكولات تحريك الأقفاص5،8،9. تقوم غرف القضبان المنزلقة تلقائيا بمسح القضبان عبر الجزء السفلي من القفص ، مما يجبر الفئران على المشي فوقها والبقاء مستيقظا. تتضمن بروتوكولات تحريك الأقفاص وضع أقفاص على الهزازات المدارية المختبرية ، مما يؤدي إلى اضطراب فعال في النوم. في حين أن هذه الطرق تلقائية وفعالة ، إلا أنها قد تكون باهظة الثمن عندما تكون هناك حاجة إلى أجهزة متعددة للعمل بالتوازي ، خاصة بالنسبة لتصميمات الدراسة المحددة التي تتضمن عددا كبيرا من الفئران المحرومة من النوم اللازمة للتنميط الجيني اليومي. من ناحية أخرى ، تعد منصات المياه وبروتوكولات المناولة اللطيفة طرقا أرخص وأبسط تستخدم عادة للحث على الحرمان من النوم. ومع ذلك ، لا تسمح منصة المياه بالتحكم التلقائي في دورات الحرمان والراحة المحددة مسبقا10,11 ، وتتطلب المعالجة اللطيفة يقظة مستمرة من الباحثين لإزعاج النوم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الخلط بين الطرائق الأخرى ، مثل الطبول الدوارة ، بسبب العزلة الاجتماعية أو الإجهاد12.

مستوحاة من الطريقة القائمة على الهزاز المداري ، نهدف إلى تقديم بروتوكول لإنشاء جهاز قائم على منصة الروك للحرمان من النوم في الفئران. هذه الطريقة رخيصة وفعالة ومرهقة إلى الحد الأدنى ويمكن التحكم فيها وآلية. يسمح لنا البروتوكول الحالي بإنشاء جهاز قائم على منصة الروك بتكلفة أرخص بعشر مرات تقريبا من الهزازات المدارية ، بناء على إمكانية الوصول إلينا. عطل هذا الجهاز النوم بشكل فعال في الفئران الجماعية وتسبب في تغييرات مميزة للحرمان من النوم مع الحد الأدنى من الاستجابة للإجهاد. سيكون مفيدا بشكل خاص للباحثين المهتمين بالتحقيق في الآثار والآليات الأساسية للحرمان من النوم على التسبب في أمراض متعددة ، خاصة عندما تنطوي الدراسة على الحرمان من النوم متعدد المجموعات بالتوازي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات التجارب على في هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات رعاية المختبري في مستشفى رينجي ، كلية الطب ، جامعة شنغهاي جياو تونغ. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8 إلى 10 أسابيع ، في الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتم سرد الأجزاء الرئيسية المطلوبة لإنشاء الجهاز في الشكل 1A.

1. إعداد جهاز الحرمان من النوم

  1. قم بتأمين أحد طرفي قناة فولاذية مشقوقة 50 سم في منتصف قناة فولاذية مشقوقة 40 سم بمسامير (انظر جدول المواد) لعمل هيكل على شكل حرف T ؛ كرر العملية واصنع هيكلين على شكل حرف T (الشكل 1B-a).
  2. اجعل الهيكلين على شكل حرف T يقفان لأعلى بتوازي 30 سم ، وقم بتوصيل قيعان الهيكلين على شكل حرف T بأسطوانة فولاذية متوافقة مع المسمار مقاس 30 سم (انظر جدول المواد) باستخدام البراغي (الشكل 1B-b).
  3. ضع منصة مستطيلة فولاذية (20 × 25 سم) (انظر جدول المواد) بين الهيكلين على شكل حرف T (الشكل 1B-c).
    ملاحظة: في حالة عدم توفر منصات مستطيلة فولاذية جاهزة للاستخدام بالحجم المحدد ، يمكن للمرء أن يصنع واحدة عن طريق لحام الفولاذ المسطح بسمك 2 مم.
  4. قم بتأمين كل طرف من طرفي أسطوانة فولاذية متوافقة مع المسمار مقاس 30 سم متصلة في المنصة بمحملين مثبتين على كل هيكل على شكل حرف T على بعد 10 سم لأسفل من الأعلى (الشكل 1B-d).
  5. قم بتأمين حامل محرك (انظر جدول المواد) على أحد الهياكل على شكل حرف T على بعد 25 سم لأسفل من الأعلى باستخدام البراغي (الشكل 1B-e).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام لاصق البناء لتأمين حامل المحرك على الهيكل على شكل حرف T بدلا من الأطقم.
  6. قم بتركيب محرك (انظر جدول المواد) على حامل المحرك بمسامير (الشكل 1B-f).
  7. قم بتأمين مروحة تبريد (انظر جدول المواد) بأشرطة ذاتية القفل على الهيكل على شكل حرف T أسفل المحرك (الشكل 1B-g).
  8. ثبت طرف محمل قضيب التوصيل بزاوية منصة تواجه المحرك باستخدام مسامير (الشكل 1B-h).
  9. ثبت طرفا آخر من قضيب التوصيل بعمود المحرك باستخدام البراغي (الشكل 1B-i).
  10. احفر فتحتين مقاس 4 مم في كل زاوية من الزوايا الأربع لحاوية بلاستيكية أو قفص قياسي (انظر جدول المواد) باستخدام مثقاب كهربائي ، وحفر فتحتين مقاس 4 مم وفتحة سفلية 6 مم على الجانب الأيسر من القفص (الشكل 1B-j).
  11. قم بتأمين القفص على منصة المستطيل بأشرطة ذاتية القفل من خلال فتحات الزاوية (الشكل 1B-k).
  12. قم بحفر ثقب 5 مم في غطاء أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام مثقاب كهربائي ، وقم بتوصيل الفتحة بفوهة طويلة مزودة بصمام كروي لمنع تسرب المياه.
    ملاحظة: سيكون هيدروجيل خيارا بديلا لإمدادات المياه إذا كان تخصيص زجاجات المياه أمرا صعبا.
  13. قم بتأمين زجاجة الماء المخصصة على الجانب الأيسر من القفص باستخدام أشرطة ذاتية القفل من خلال فتحتين مقاس 4 مم ، مع مرور الفوهة عبر فتحة 6 مم (الشكل 1B-l).
  14. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية الناتجة لمحول طوب الطاقة بطرفي المحرك (الشكل 1B-l).
    ملاحظة: لا توجد متطلبات قطبية محددة لتوصيل الأسلاك بأطراف المحرك.
  15. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية المدخلة لمحول طوب الطاقة بموصل الوقت (الشكل 1B-m).

2. تحريض الحرمان من النوم

  1. اضغط على أزرار علامة الجمع في أقصى اليمين على النصفين الأيسر والأيمن من موصل الوقت (انظر جدول المواد) ، على التوالي ، حتى يظهر "M" على العدادات الميكانيكية على كلا الجانبين (الشكل 1C-a).
  2. اضغط على أزرار علامة الجمع الوسطى على النصفين الأيسر والأيمن من موصل الوقت حتى يظهر "5M" على العدادات الميكانيكية على كلا الجانبين (الشكل 1C-b).
  3. اضغط على زر علامة الجمع في أقصى اليسار في النصف الأيسر من موصل الوقت حتى يظهر "15M" على العداد الميكانيكي الأيسر (الشكل 1C-c).
    ملاحظة: سيتم بعد ذلك تشغيل موصل الوقت لمدة 15 دقيقة وإيقاف تشغيله لمدة 5 دقائق في الوضع الدوري.
  4. ضع الفئران في القفص بالماء والطعام الإعلاني.
  5. تزويد موصل الوقت ومروحة التبريد بالطاقة.
    ملاحظة: ستتأرجح المنصة الآن عند 10 دورات في الدقيقة.
  6. قم بوزن كل فأر في وقت Zeitgeber 0 (ZT0) كل يوم.
    ملاحظة: يضيء الضوء من الساعة 8 صباحا (ZT0) إلى الساعة 8 مساء (ZT12).

3. اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم

  1. قياس مستويات الجلوكوز الصائم في الفئران الصائمة عن طريق أخذ عينات من الدم من أوردة الذيل.
  2. حقن محلول الجلوكوز في كل فأر (2 جم / كجم من وزن الجسم) داخل الصفاق باستخدام محاقن سعة 1 مل.
  3. جمع عينات الدم من خلال الوريد الذيل، واختبار الجلوكوز في الدم في 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 120 دقيقة بعد حقن الجلوكوز ، على التوالي.
  4. ضع الفئران مرة أخرى في القفص مع الطعام والماء ad libitum بعد الاختبار.

4. حصاد أنسجة المخ

  1. قطع رأس الفئران بعد التخدير الكافي عن طريق تعريضها للأيزوفلوران (2٪) لمدة 3-5 دقائق.
  2. كشف الجمجمة وجعل قطع عمودي 1 سم في الجمجمة باستخدام مقص جراحي.
  3. قم بإزالة الجمجمة باستخدام مرقئ البعوض (انظر جدول المواد) لكشف أنسجة المخ.
  4. حرك الدماغ بالكامل برفق خارج تجويف الجمجمة باستخدام ملاقط منحنية.
    ملاحظة: يجب إزالة أنسجة المخ وفقا للسياسات المحلية.
  5. اغسل أنسجة المخ باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (1x PBS ، 4 درجات مئوية).
  6. قم بتجميد أنسجة المخ السليمة في النيتروجين السائل وانقل الأنسجة إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
    ملاحظة: عند تخزينها في -80 درجة مئوية ، تكون أنسجة المخ المجمدة بالفلاش مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.

5. الكشف عن التعبير الجيني عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

  1. قم بإذابة أنسجة المخ عند 4 درجات مئوية أو على الثلج.
  2. نقل الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل ، واستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الطريقة القائمة على تريزول13.
  3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد) بعد استخراج الحمض النووي الريبي.
  4. قم بإجراء النسخ العكسي لإجمالي الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام) إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة تجارية14.
  5. قياس مستويات التعبير الجيني عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الفعلي15.

النتائج

يظهر الجهاز الثابت للحرمان من النوم في الفئران في الشكل 1 د. في اليوم 7 بعد بدء الحرمان من النوم ، أشار مخطط كهربية الدماغ (EEG) ومراقبة تخطيط كهربية العضل (EMG)16 إلى أن الجهاز قلل بشكل كبير من مدة النوم وزاد من مدة اليقظة في الفئران (الشكل 2A-D...

Discussion

تعد نماذج الفئران للحرمان من النوم ضرورية لدراسة آثار اضطراب النوم على الأمراض المختلفة ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية21 ، والحالات النفسية22 ، والاضطرابات العصبية23. من بين استراتيجيات الحرمان من النوم الحالية في الفئران ، فإن الأساليب ال?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82230014 ، 81930007 ، 82270342) ، وبرنامج شنغهاي للقادة الأكاديميين المتميزين (18XD1402400) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (22QA1405400 ، 201409005200 ، 20YF1426100) ، برنامج شنغهاي بوجيانغ للمواهب (2020PJD030) ، SHWSRS (2023-62) ، مركز شنغهاي للبحوث السريرية للشيخوخة والطب (19MC1910500) ، وبرنامج الابتكار للدراسات العليا في كلية بنغبو الطبية (Byycxz21075).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C-S
50 mL centrifuge tubeNEST602002
Adenosine ELISA kitRuifan technologyRF8885
Animal cageZeYa techMJ2
Blood glucose meterYuYue580
C57BL/6J MiceJieSiJie Laboratory AnimalN/AAge: 8-10 weeks
Connecting rodShengXiang TechN/ALength:  20 cm
Cooling fanLiMingEFB0805VHSupply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kitElabscienceE-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis systemPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluraneRWD20071302
mosquito hemostatsFST13011-12Surgical instrument
Motor and motor mountMingYangMY36GP-555Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Power brick adapterMingYangQiYe-0243Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kitVazymeQ711-02
qPCR measurement equipmentRoche480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinderCustomizedN/AWidth: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kitVazymeR323-01
Screw and nutGuwanjiN/AInner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinderCustomizedN/ALength: 300 mm
Slotted steel channelsCustomizedN/ALength: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactorLiXiangDH48S-SSupply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzolVazymeR401-01

References

  1. Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292 (2023).
  2. Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
  3. Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
  4. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  5. Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90 (2019).
  6. Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
  7. Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
  8. Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35 (2022).
  9. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  10. Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
  11. Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559 (2016).
  12. Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
  13. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  14. Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
  15. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  16. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
  17. Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
  18. Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
  19. Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
  20. Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
  21. Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
  22. Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430 (2014).
  23. Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017 (2020).
  24. Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
  25. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  26. Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved