הקמת מכשיר למניעת שינה בעכברים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה להקמת מכשיר חסכוני מבוסס פלטפורמת נדנדה המשמש לגרימת חסך שינה בעכברים. מכשיר זה הוכח כיעיל בגרימת שיבושים בדפוסי השינה המוכחים באלקטרואנצפלוגרם (EEG), כמו גם בגרימת שינויים מטבוליים ומולקולריים הקשורים למחסור בשינה.

Abstract

הפרעה בשעון הביולוגי מתייחסת לחוסר סנכרון בין הסביבה או ההתנהגות החיצונית לבין השעון המולקולרי האנדוגני, אשר פוגע באופן משמעותי בבריאות. מחסור בשינה הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר להפרעה בשעון הביולוגי. שיטות שונות (למשל, פלטפורמות על המים, טיפול עדין, תאי מוטות הזזה, תופים מסתובבים, שייקרים מסלוליים וכו ') דווחו כגורמים לחוסר שינה בעכברים כדי לחקור את השפעותיו על הבריאות. המחקר הנוכחי מציג שיטה חלופית למחסור בשינה בעכברים. תוכנן מכשיר אוטומטי מבוסס פלטפורמת נדנדה שהוא חסכוני ומשבש ביעילות את השינה בעכברים השוכנים בקבוצה בפרקי זמן מתכווננים. מכשיר זה גורם לשינויים אופייניים של חסך שינה עם תגובת לחץ מינימלית. כתוצאה מכך, שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור חוקרים המעוניינים לחקור את ההשפעות ואת המנגנונים הבסיסיים של מניעת שינה על הפתוגנזה של מחלות מרובות. יתר על כן, הוא מציע פתרון חסכוני, במיוחד כאשר נדרשים מכשירים מרובים למניעת שינה לפעול במקביל.

Introduction

הפרעה בשעון הביולוגי מתייחסת לדה-סנכרון בין הסביבה או ההתנהגות החיצונית לבין השעון הביולוגי האנדוגני. אחד הגורמים השכיחים ביותר להפרעה בשעון הביולוגי הוא חסך שינה¹. מחסור בשינה לא רק משפיע לרעה על בריאות האדם, אלא גם מגדיל באופן משמעותי את הסיכון למחלות רבות, כולל סרטן² ומחלות לב וכלי דם³. עם זאת, המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות המזיקות של מניעת שינה עדיין אינם ידועים במידה רבה, והקמת מודלים של מניעת שינה חיונית כדי לשפר את הבנתנו בהקשר זה.

דווח על שיטות שונות למניעת שינה בעכברים, כגון שימוש בפלטפורמות מים⁴, טיפול עדין⁵, תאי מוטות הזזה⁶, תופים מסתובבים⁷ ופרוטוקולי תסיסה בכלוב ^5,8,9. תאי מוטות הזזה גורפים אוטומטית סורגים את תחתית הכלוב, ומאלצים את העכברים ללכת מעליהם ולהישאר ערים. פרוטוקולי תסיסה בכלובים כוללים הצבת כלובים על מטלטלים מסלוליים במעבדה, וכתוצאה מכך הפרעות שינה יעילות. בעוד שיטות אלה הן אוטומטיות ויעילות, הן יכולות להיות יקרות כאשר מכשירים מרובים נדרשים לפעול במקביל, במיוחד עבור עיצובי מחקר ספציפיים הכוללים מספר רב של עכברים חסרי שינה הדרושים לפרופיל גנים צירקדיים. מצד שני, פלטפורמות מים ופרוטוקולי טיפול עדינים הם שיטות זולות ופשוטות יותר המשמשות בדרך כלל לגרימת חסך שינה. עם זאת, אסדת המים אינה מאפשרת בקרה אוטומטית של מחזורי מנוחה-חסך שנקבעו מראש ^10,11, וטיפול עדין דורש ערנות מתמשכת מצד החוקרים כדי להפריע לשינה. בנוסף, שיטות אחרות, כמו תופים מסתובבים, יכולות להתבלבל על ידי בידוד חברתי או מתח¹².

בהשראת השיטה המבוססת על שייקר מסלולי, אנו שואפים להציג פרוטוקול להקמת מכשיר מבוסס פלטפורמת נדנדה למניעת שינה בעכברים. שיטה זו זולה, יעילה, מלחיצה באופן מינימלי, ניתנת לשליטה ואוטומטית. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר לנו ליצור מכשיר מבוסס פלטפורמת נדנדה בעלות זולה בערך פי עשרה מזו של מטלטלים מסלוליים, בהתבסס על הנגישות שלנו. מכשיר זה שיבש ביעילות את השינה בעכברים ששוכנו בקבוצה וגרם לשינויים אופייניים של חסך שינה עם תגובת דחק מינימלית. זה יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים המעוניינים לחקור את ההשפעות ואת המנגנונים הבסיסיים של מניעת שינה על הפתוגנזה של מחלות מרובות, במיוחד כאשר המחקר כולל מניעת שינה מרובת קבוצות במקביל.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים במעבדה של בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי. עכברי C57BL/6J זכרים, בגילאי 8 עד 10 שבועות, שימשו במחקר. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). החלקים העיקריים הדרושים להקמת המכשיר מפורטים באיור 1A.

1. הכנת המכשיר למניעת שינה

1. אבטח קצה אחד של תעלת פלדה מחורצת בקוטר 50 ס"מ באמצע תעלת פלדה מחורצת בקוטר 40 ס"מ באמצעות ברגים (ראה טבלת חומרים) ליצירת מבנה בצורת T; חזרו על התהליך וצרו שני מבנים כאלה בצורת T (איור 1B-a).
2. גרמו לשני המבנים בצורת T לעמוד כלפי מעלה במקביל במרחק של 30 ס"מ זה מזה, וחברו את התחתונים של שני המבנים בצורת T עם גליל פלדה תואם בורג בקוטר 30 ס"מ (ראו טבלת חומרים) באמצעות ברגים (איור 1B-b).
3. הניחו משטח מלבן פלדה (20 × 25 ס"מ) (ראו טבלת חומרים) בין שני המבנים בצורת T (איור 1B-c).
   הערה: אם פלטפורמות מלבן פלדה מוכנות לשימוש בגודל שצוין אינן זמינות, ניתן ליצור אחת על ידי ריתוך פלדות שטוחות בעובי 2 מ"מ.
4. אבטחו כל קצה של גליל פלדה תואם בורג בקוטר 30 ס"מ המחובר בפלטפורמה לשני מיסבים קבועים על כל אחד מהמבנים בצורת T במרחק של 10 ס"מ למטה מהחלק העליון (איור 1B-d).
5. הדקו תושבת מנוע (ראו טבלת חומרים) על אחד המבנים בצורת T בגובה 25 ס"מ למטה מהחלק העליון באמצעות ברגים (איור 1B-e).
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בדבק בנייה כדי לאבטח את תושבת המנוע על המבנה בצורת T במקום צוותים.
6. התקינו מנוע (ראו טבלת חומרים) על תושבת המנוע עם ברגים (איור 1B-f).
7. אבטחו מאוורר קירור (ראו טבלת חומרים) עם רצועות נעילה עצמית במבנה בצורת T מתחת למנוע (איור 1B-g).
8. קבע את קצה המסב של מוט חיבור לפינת פלטפורמה הפונה למנוע באמצעות ברגים (איור 1B-h).
9. קבע קצה נוסף של מוט החיבור למוט המנוע באמצעות ברגים (איור 1B-i).
10. קדחו שני חורים בקוטר 4 מ"מ בכל אחת מארבע הפינות של מכל פלסטיק או כלוב חיות סטנדרטי (ראו טבלת חומרים) באמצעות מקדחה חשמלית, וקדחו שני חורים בקוטר 4 מ"מ וחור תחתון בקוטר 6 מ"מ בצד שמאל של הכלוב (איור 1B-j).
11. אבטחו את הכלוב על משטח המלבן באמצעות רצועות נעילה עצמית דרך חורי הפינה (איור 1B-k).
12. קדח חור 5 מ"מ במכסה של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם מקדחה חשמלית, וחבר את החור עם זרבובית ארוכה המצוידת בשסתום כדורי למניעת דליפת מים.
    הערה: הידרוג'ל יהיה אופציה חלופית לאספקת מים אם קשה להתאים אישית בקבוקי מים.
13. אבטחו את בקבוק המים המותאם אישית בצד שמאל של הכלוב באמצעות רצועות נעילה עצמית דרך שני חורים בקוטר 4 מ"מ, כאשר הזרבובית עוברת דרך חור ה-6 מ"מ (איור 1B-l).
14. חברו את חוטי החשמל היוצאים של מתאם לבני החשמל לשני הדקים של המנוע (איור 1B-l).
    הערה: אין דרישת קוטביות ספציפית לחיבור החוטים להדקי המנוע.
15. חברו את חוטי החשמל של מתאם לבני החשמל למגע הזמן (איור 1B-m).

2. אינדוקציה של מניעת שינה

1. לחצו על לחצני סימן הפלוס הימני ביותר בחצי השמאלי והימני של מגע הזמן (ראו טבלת חומרים), בהתאמה, עד שיופיע האות M על הדלפקים המכניים משני הצדדים (איור 1C-a).
2. לחצו על כפתורי סימן הפלוס האמצעיים בחצי השמאלי והימני של מגע הזמן עד שיופיע "5M" על הדלפקים המכניים משני הצדדים (איור 1C-b).
3. לחץ על לחצן סימן הפלוס השמאלי ביותר בחצי השמאלי של מגע הזמן עד שיופיע "15M" על המונה המכני השמאלי (איור 1C-c).
   הערה: לאחר מכן מגע הזמן יהיה מופעל למשך 15 דקות וכבוי למשך 5 דקות במצב מחזורי.
4. הכניסו עכברים לכלוב עם מים ומזון עד ליביטום.
5. ספק חשמל למגע הזמן ולמאוורר הקירור.
   הערה: הפלטפורמה תתנדנד כעת ב-10 סל"ד.
6. שקול כל עכבר בזמן Zeitgeber 0 (ZT0) בכל יום.
   הערה: האור דולק מ-8 בבוקר (ZT0) עד 20:00 בערב (ZT12).

3. בדיקת סובלנות גלוקוז דרך הפה

1. מדדו את רמות הגלוקוז בצום בעכברים בצום על ידי דגימת דם מוורידי הזנב.
2. הזריקו תמיסת גלוקוז לכל עכבר (2 גרם/ק"ג משקל גוף) תוך צפקית באמצעות מזרקים של 1 מ"ל.
3. לאסוף דגימות דם דרך וריד הזנב, ולבדוק את רמת הגלוקוז בדם ב 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, ו 120 דקות לאחר הזרקת גלוקוז, בהתאמה.
4. החזירו את העכברים לכלוב עם המזון והמים לאחר הבדיקה.

4. קצירת רקמות המוח

1. ערפו את ראשיהם של העכברים לאחר הרדמה מספקת על ידי חשיפתם לאיזופלורן (2%) למשך 3-5 דקות.
2. חשוף את הגולגולת ובצע חתך אנכי של 1 ס"מ בגולגולת באמצעות מספריים כירורגיים.
3. הסר את הגולגולת באמצעות המוסטטים של יתושים (ראה טבלת חומרים) כדי לחשוף את רקמת המוח.
4. הוציאו בעדינות את כל המוח מחלל הגולגולת באמצעות פינצטה מעוקלת.
   הערה: יש להסיר רקמת מוח בהתאם למדיניות המקומית.
5. שטפו את רקמת המוח באמצעות מלח חוצץ פוספט קר (1x PBS, 4 °C).
6. הצמד להקפיא את רקמת המוח השלמה בחנקן נוזלי ולהעביר את הרקמה ל -80 ° C לאחסון לטווח ארוך .
   הערה: כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של -80°C, רקמת המוח שהוקפאה במהירות הבזק יציבה למשך 6 חודשים לפחות.

5. זיהוי ביטוי גנים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR)

1. הפשירו את רקמות המוח בטמפרטורה של 4°C צלזיוס או על קרח.
2. מעבירים את הרקמה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ומחלצים את סך הרנ"א בשיטה¹³ המבוססת על TRIzol.
3. למדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר (ראו טבלת חומרים) לאחר מיצוי הרנ"א.
4. בצע שעתוק לאחור של סך כל הרנ"א (1 מיקרוגרם) לדנ"א משלים (cDNA) באמצעות ערכה מסחרית¹⁴.
5. מדידת רמות ביטוי גנים על ידי תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור בזמן אמת¹⁵.

תוצאות

המכשיר שנקבע למניעת שינה בעכברים מוצג באיור 1D. ביום השביעי לאחר תחילת החסך בשינה, ניטור אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ואלקטרומיוגרפיה (EMG)¹⁶ הצביע על כך שהמכשיר הפחית באופן משמעותי את משך השינה והגדיל את משך הערות בעכברים (איור 2A-D). בינת?...

Discussion

מודלים עכבריים של חסך שינה חיוניים לחקר ההשפעות של הפרעות שינה על מחלות שונות, כולל מחלות לב וכלי דם²¹, מצבים פסיכיאטריים²² והפרעות נוירולוגיות²³. מבין אסטרטגיות מניעת השינה הקיימות בעכברים, גישות פיזיות הכוללות הפרעות חוזרות ונשנות לטווח קצר של שינה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
50 mL centrifuge tube	NEST	602002
Adenosine ELISA kit	Ruifan technology	RF8885
Animal cage	ZeYa tech	MJ2
Blood glucose meter	YuYue	580
C57BL/6J Mice	JieSiJie Laboratory Animal	N/A	Age: 8-10 weeks
Connecting rod	ShengXiang Tech	N/A	Length:  20 cm
Cooling fan	LiMing	EFB0805VH	Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kit	Elabscience	E-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis system	Pinnacle Technology	8200-K1-iSE3
Isoflurane	RWD	20071302
mosquito hemostats	FST	13011-12	Surgical instrument
Motor and motor mount	MingYang	MY36GP-555	Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c
Power brick adapter	MingYang	QiYe-0243	Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kit	Vazyme	Q711-02
qPCR measurement equipment	Roche	480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kit	Vazyme	R323-01
Screw and nut	Guwanji	N/A	Inner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Length: 300 mm
Slotted steel channels	Customized	N/A	Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactor	LiXiang	DH48S-S	Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzol	Vazyme	R401-01