Etablierung eines Geräts gegen Schlafentzug bei Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode zur Einrichtung eines kostengünstigen Rocker-Plattform-basierten Geräts, das zur Induktion von Schlafentzug bei Mäusen verwendet wird. Dieses Gerät hat sich als wirksam erwiesen, wenn es darum geht, Störungen des durch Elektroenzephalogramm (EEG) nachgewiesenen Schlafmusters zu verursachen und metabolische und molekulare Veränderungen im Zusammenhang mit Schlafentzug zu induzieren.

Zusammenfassung

Die Störung des zirkadianen Rhythmus bezieht sich auf die Desynchronisation zwischen der äußeren Umgebung oder dem Verhalten und der endogenen molekularen Uhr, die die Gesundheit erheblich beeinträchtigt. Schlafentzug ist eine der häufigsten Ursachen für eine Störung des zirkadianen Rhythmus. Es wurde über verschiedene Modalitäten (z. B. Plattformen auf dem Wasser, schonende Handhabung, Gleitstangenkammern, rotierende Trommeln, Orbitalschüttler usw.) berichtet, um Schlafentzug bei Mäusen zu induzieren, um seine Auswirkungen auf die Gesundheit zu untersuchen. Die aktuelle Studie stellt eine alternative Methode für Schlafentzug bei Mäusen vor. Es wurde ein automatisiertes Gerät entwickelt, das auf einer Wippplattform basiert, das kostengünstig ist und den Schlaf von Mäusen in Gruppenhaltung in einstellbaren Zeitintervallen effizient stört. Dieses Gerät induziert charakteristische Veränderungen des Schlafentzugs bei minimaler Stressreaktion. Folglich kann sich diese Methode als nützlich für Forscher erweisen, die daran interessiert sind, die Auswirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen von Schlafentzug auf die Pathogenese mehrerer Krankheiten zu untersuchen. Darüber hinaus bietet es eine kostengünstige Lösung, insbesondere wenn mehrere Schlafentzugsgeräte parallel laufen müssen.

Einleitung

Die Störung des zirkadianen Rhythmus bezieht sich auf die Desynchronisation zwischen der äußeren Umgebung oder dem Verhalten und der endogenen biologischen Uhr. Eine der häufigsten Ursachen für eine Störung des zirkadianen Rhythmus ist Schlafentzug¹. Schlafmangel wirkt sich nicht nur negativ auf die menschliche Gesundheit aus, sondern erhöht auch das Risiko für viele Krankheiten, darunter Krebs² und Herz-Kreislauf-Erkrankungen³, erheblich. Die Mechanismen, die den schädlichen Auswirkungen von Schlafentzug zugrunde liegen, sind jedoch noch weitgehend unbekannt, und die Etablierung von Schlafentzugsmodellen ist unerlässlich, um unser Verständnis in dieser Hinsicht zu verbessern.

Es wurde über verschiedene Methoden zur Schlafentziehung bei Mäusen berichtet, wie z. B. die Verwendung von Wasserplattformen⁴, schonende Handhabung⁵, Gleitstangenkammern⁶, rotierende Trommeln⁷ und Käfigrührprotokolle ^5,8,9. Schiebestangenkammern fegen automatisch über den Boden des Käfigs und zwingen die Mäuse, darüber zu laufen und wach zu bleiben. Bei den Käfig-Rührprotokollen werden Käfige auf Labor-Orbitalschüttler gesetzt, was zu einer effizienten Schlafstörung führt. Diese Methoden sind zwar automatisch und effektiv, können aber teuer sein, wenn mehrere Geräte parallel laufen müssen, insbesondere bei spezifischen Studiendesigns, die eine große Anzahl von Mäusen mit Schlafentzug umfassen, die für die Erstellung eines zirkadianen Genprofils benötigt werden. Auf der anderen Seite sind Wasserplattformen und sanfte Handhabungsprotokolle billigere und einfachere Methoden, die häufig verwendet werden, um Schlafentzug herbeizuführen. Die Wasserplattform erlaubt jedoch keine automatische Steuerung der vorgegebenen Entzugs-Ruhe-Zyklen^10,11, und die schonende Handhabung erfordert von den Forschern eine kontinuierliche Wachsamkeit, um den Schlaf zu stören. Darüber hinaus können andere Modalitäten, wie rotierende Trommeln, durch soziale Isolation oder Stress verwirrt werden¹².

Inspiriert von der orbitalen Shaker-basierten Methode wollen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Rocker-Plattform-basierten Geräts für Schlafentzug bei Mäusen einführen. Diese Methode ist billig, effektiv, minimal stressig, kontrollierbar und automatisiert. Das derzeitige Protokoll ermöglicht es uns, ein auf der Wippplattform basierendes Gerät zu einem Preis zu entwickeln, der etwa zehnmal billiger ist als der von Orbitalschüttlern, basierend auf unserer Zugänglichkeit. Dieses Gerät störte effektiv den Schlaf von Mäusen, die in Gruppen gehalten wurden, und induzierte charakteristische Veränderungen des Schlafentzugs bei minimaler Stressreaktion. Es wird besonders nützlich für Forscher sein, die daran interessiert sind, die Auswirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen von Schlafentzug auf die Pathogenese mehrerer Krankheiten zu untersuchen, insbesondere wenn die Studie mehrere Gruppen parallel Schlafentzug umfasst.

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Protokoll

Alle Tierversuchsprotokolle in dieser Studie wurden von der Ethikkommission für das Wohlergehen von Labortieren des Renji-Krankenhauses, Medizinische Fakultät, Shanghai Jiao Tong Universität, genehmigt. In der Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die wichtigsten Teile, die für die Einrichtung des Geräts erforderlich sind, sind in Abbildung 1A aufgeführt.

1. Vorbereitung des Schlafentzugsgeräts

1. Befestigen Sie ein Ende einer 50 cm langen geschlitzten Stahlrinne in der Mitte einer 40 cm langen geschlitzten Stahlrinne mit Schrauben (siehe Materialtabelle), um eine T-förmige Struktur zu erhalten. Wiederholen Sie den Vorgang und stellen Sie zwei solcher T-förmigen Strukturen her (Abbildung 1B-a).
2. Lassen Sie die beiden T-förmigen Strukturen parallel im Abstand von 30 cm nach oben stehen und verbinden Sie die Böden der beiden T-förmigen Strukturen mit einem 30 cm langen schraubkompatiblen Stahlzylinder (siehe Materialtabelle) mit Schrauben (Abbildung 1B-b).
3. Platzieren Sie eine rechteckige Plattform aus Stahl (20 × 25 cm) (siehe Materialtabelle) zwischen den beiden T-förmigen Strukturen (Abbildung 1B-c).
   HINWEIS: Wenn keine gebrauchsfertigen rechteckigen Stahlplattformen in der angegebenen Größe verfügbar sind, kann man eine durch Schweißen von 2 mm dicken Flachstählen herstellen.
4. Befestigen Sie jedes Ende eines 30 cm langen, schraubkompatiblen Stahlzylinders, der in der Plattform befestigt ist, an zwei Lagern, die an jeder der T-förmigen Strukturen 10 cm von der Oberseite entfernt befestigt sind (Abbildung 1B-d).
5. Befestigen Sie eine Motorhalterung (siehe Materialtabelle) mit Schrauben an einer der T-förmigen Strukturen in einem Abstand von 25 cm von oben (Abbildung 1B-e).
   HINWEIS: Alternativ kann Konstruktionskleber verwendet werden, um die Motorhalterung anstelle von Crews an der T-förmigen Struktur zu befestigen.
6. Montieren Sie einen Motor (siehe Materialtabelle) mit Schrauben an der Motorhalterung (Abbildung 1B-f).
7. Befestigen Sie einen Lüfter (siehe Materialtabelle) mit selbstsichernden Bändern an der T-förmigen Struktur unterhalb des Motors (Abbildung 1B-g).
8. Befestigen Sie das Lagerende einer Pleuelstange mit Schrauben an einer dem Motor zugewandten Plattformecke (Abbildung 1B-h).
9. Ein weiteres Ende der Pleuelstange mit Schrauben an der Welle des Motors befestigen (Abbildung 1B-i).
10. Bohren Sie mit einem Bohrer zwei 4-mm-Löcher an jeder der vier Ecken eines Kunststoffbehälters oder eines Standard-Tierkäfigs (siehe Materialtabelle) und bohren Sie zwei 4-mm-Löcher und ein unteres 6-mm-Loch auf der linken Seite des Käfigs (Abbildung 1B-j).
11. Befestigen Sie den Käfig auf der rechteckigen Plattform mit selbstsichernden Bändern durch die Ecklöcher (Abbildung 1B-k).
12. Bohren Sie mit einem Bohrer ein 5 mm großes Loch in die Kappe eines 50-ml-Zentrifugenröhrchens und stopfen Sie das Loch mit einer langen Düse, die mit einem Kugelhahn ausgestattet ist, um ein Austreten von Wasser zu verhindern.
    HINWEIS: Hydrogel wäre eine alternative Option für die Wasserversorgung, wenn die Anpassung von Wasserflaschen schwierig ist.
13. Befestigen Sie die angepasste Wasserflasche auf der linken Seite des Käfigs mit selbstsichernden Bändern durch die beiden 4-mm-Löcher, wobei die Düse durch das 6-mm-Loch führt (Abbildung 1B-l).
14. Verbinden Sie die elektrischen Ausgangsdrähte des Netzteiladapters mit den beiden Anschlüssen des Motors (Abbildung 1B-l).
    HINWEIS: Es gibt keine spezielle Polaritätsanforderung für den Anschluss der Drähte an die Motorklemmen.
15. Verbinden Sie die elektrischen Eingangsdrähte des Netzteiladapters mit dem Zeitschütz (Abbildung 1B-m).

2. Induktion von Schlafentzug

1. Drücken Sie die Tasten ganz rechts auf der linken bzw. rechten Hälfte des Zeitschützes (siehe Materialtabelle), bis auf den mechanischen Zählern auf beiden Seiten "M" erscheint (Abbildung 1C-a).
2. Drücken Sie die mittleren Pluszeichentasten in der linken und rechten Hälfte des Zeitschützes, bis auf den mechanischen Zählern auf beiden Seiten "5M" erscheint (Abbildung 1C-b).
3. Drücken Sie die Pluszeichentaste ganz links in der linken Hälfte des Zeitschützes, bis "15M" auf dem linken mechanischen Zähler erscheint (Abbildung 1C-c).
   HINWEIS: Das Zeitschütz ist dann im zyklischen Modus für 15 Minuten eingeschaltet und für 5 Minuten ausgeschaltet.
4. Setze Mäuse ad libitum mit Wasser und Futter in den Käfig.
5. Versorgen Sie das Zeitschütz und den Lüfter mit Strom.
   HINWEIS: Die Plattform schaukelt jetzt mit 10 Umdrehungen pro Minute.
6. Wiegen Sie jede Maus jeden Tag zur Zeitgeberzeit 0 (ZT0).
   HINWEIS: Das Licht ist von 8 Uhr (ZT0) bis 20 Uhr (ZT12) eingeschaltet.

3. Oraler Glukosetoleranztest

1. Messen Sie den Nüchternglukosespiegel bei nüchternen Mäusen, indem Sie Blutproben aus den Schwanzvenen entnehmen.
2. Glukoselösung (2 g/kg Körpergewicht) intraperitoneal mit 1-ml-Spritzen injizieren.
3. Entnehmen Sie Blutproben durch die Schwanzvene und testen Sie den Blutzucker 15 min, 30 min, 60 min bzw. 120 min nach der Glukoseinjektion.
4. Setzen Sie die Mäuse nach dem Test ad libitum mit dem Futter und dem Wasser zurück in den Käfig.

4. Entnahme des Hirngewebes

1. Enthaupten Sie die Mäuse nach angemessener Anästhesie, indem Sie sie 3-5 Minuten lang Isofluran (2%) aussetzen.
2. Legen Sie den Schädel frei und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1 cm langen vertikalen Schnitt am Schädel.
3. Entfernen Sie den Schädel mit Hilfe von Mückenhämotaten (siehe Materialtabelle), um das Hirngewebe freizulegen.
4. Bewegen Sie das gesamte Gehirn vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette aus der Schädelhöhle.
   HINWEIS: Hirngewebe sollte gemäß den örtlichen Richtlinien entfernt werden.
5. Waschen Sie das Hirngewebe mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS, 4 °C).
6. Das intakte Hirngewebe wird in flüssigem Stickstoff eingefroren und zur Langzeitlagerung auf -80 °C überführt.
   HINWEIS: Bei Lagerung bei -80 °C ist das schockgefrorene Hirngewebe mindestens 6 Monate lang stabil.

5. Nachweis der Genexpression mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1. Das Hirngewebe bei 4 °C oder auf Eis auftauen.
2. Übertragen Sie das Gewebe in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit der TRIzol-basierten Methode¹³.
3. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) nach der RNA-Extraktion.
4. Durchführen einer reversen Transkription der Gesamt-RNA (1 μg) in komplementäre DNA (cDNA) unter Verwendung eines handelsüblichen Kits¹⁴.
5. Messung des Genexpressionsniveaus mittels Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion^{in Echtzeit 15}.

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Ergebnisse

Das etablierte Gerät für Schlafentzug bei Mäusen ist in Abbildung 1D dargestellt. Am Tag 7 nach Beginn des Schlafentzugs zeigten Elektroenzephalogramm (EEG) und Elektromyographie (EMG)¹⁶, dass das Gerät die Schlafdauer signifikant verkürzte und die Wachdauer bei Mäusen verlängerte (Abbildung 2A-D). In der Zwischenzeit erhöhte das aktuelle Protokoll signifikant den Adenosinaufbau und die mRNA-Spieg...

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Diskussion

Mausmodelle für Schlafentzug sind unerlässlich, um die Auswirkungen von Schlafstörungen auf verschiedene Krankheiten zu untersuchen, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen²¹, psychiatrische Erkrankungen²² und neurologische Störungen²³. Unter den bestehenden Schlafentzugsstrategien bei Mäusen sind körperliche Ansätze, die eine wiederholte kurzzeitige Unterbrechung des Schlafs beinhalten, die am^{häufigsten verwendeten ...}

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
50 mL centrifuge tube	NEST	602002
Adenosine ELISA kit	Ruifan technology	RF8885
Animal cage	ZeYa tech	MJ2
Blood glucose meter	YuYue	580
C57BL/6J Mice	JieSiJie Laboratory Animal	N/A	Age: 8-10 weeks
Connecting rod	ShengXiang Tech	N/A	Length:  20 cm
Cooling fan	LiMing	EFB0805VH	Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kit	Elabscience	E-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis system	Pinnacle Technology	8200-K1-iSE3
Isoflurane	RWD	20071302
mosquito hemostats	FST	13011-12	Surgical instrument
Motor and motor mount	MingYang	MY36GP-555	Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c
Power brick adapter	MingYang	QiYe-0243	Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kit	Vazyme	Q711-02
qPCR measurement equipment	Roche	480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kit	Vazyme	R323-01
Screw and nut	Guwanji	N/A	Inner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Length: 300 mm
Slotted steel channels	Customized	N/A	Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactor	LiXiang	DH48S-S	Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzol	Vazyme	R401-01