JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, farelerde uyku yoksunluğunu indüklemek için kullanılan uygun maliyetli bir rocker platform tabanlı cihaz kurmak için bir yöntemi özetlemektedir. Bu cihazın, elektroensefalogram (EEG) ile kanıtlanmış uyku düzenlerinde bozulmalara neden olmanın yanı sıra uyku yoksunluğu ile ilişkili metabolik ve moleküler değişiklikleri indüklemede etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Özet

Sirkadiyen ritim bozulması, dış çevre veya davranış ile sağlığı önemli ölçüde bozan endojen moleküler saat arasındaki senkronizasyonun bozulmasını ifade eder. Uyku yoksunluğu, sirkadiyen ritim bozulmasının en yaygın nedenlerinden biridir. Sağlık üzerindeki etkilerini araştırmak için farelerde uyku yoksunluğuna neden olmak için çeşitli yöntemler (örneğin, su üzerindeki platformlar, nazik kullanım, kayar çubuk odaları, dönen tamburlar, yörünge çalkalayıcılar, vb.) bildirilmiştir. Bu çalışma, farelerde uyku yoksunluğu için alternatif bir yöntem sunmaktadır. Ayarlanabilir zaman aralıklarında grup halinde barındırılan farelerde uygun maliyetli ve uykuyu verimli bir şekilde bozan otomatik bir rocker platformu tabanlı cihaz tasarlanmıştır. Bu cihaz, minimum stres tepkisi ile uyku yoksunluğunun karakteristik değişikliklerine neden olur. Sonuç olarak, bu yöntem, uyku yoksunluğunun çoklu hastalıkların patogenezi üzerindeki etkilerini ve altta yatan mekanizmaları incelemekle ilgilenen araştırmacılar için yararlı olabilir. Ayrıca, özellikle birden fazla uyku yoksunluğu cihazının paralel olarak çalışması gerektiğinde uygun maliyetli bir çözüm sunar.

Giriş

Sirkadiyen ritim bozulması, dış çevre veya davranış ile endojen biyolojik saat arasındaki senkronizasyonun bozulmasını ifade eder. Sirkadiyen ritim bozukluğunun en yaygın nedenlerinden biri uyku yoksunluğudur1. Uyku yoksunluğu sadece insan sağlığını olumsuz etkilemekle kalmaz, aynı zamanda kanser2 ve kardiyovasküler hastalıklar3 dahil olmak üzere birçok hastalığın riskini önemli ölçüde artırır. Bununla birlikte, uyku yoksunluğunun zararlı etkilerinin altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir ve bu konudaki anlayışımızı geliştirmek için uyku yoksunluğu modelleri oluşturmak esastır.

Farelerde uyku yoksunluğu için su platformlarının4, nazik kullanım5, kayar çubuk odalarının6, dönen tamburların7 ve kafes ajitasyon protokollerinin5,8,9 kullanımı gibi çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Kayar çubuk odaları, çubukları kafesin alt kısmı boyunca otomatik olarak süpürür ve fareleri üzerlerinden geçmeye ve uyanık kalmaya zorlar. Kafes ajitasyon protokolleri, kafeslerin laboratuvar orbital çalkalayıcılarına yerleştirilmesini içerir ve bu da verimli uyku bozukluğuna neden olur. Bu yöntemler otomatik ve etkili olsa da, özellikle sirkadiyen gen profillemesi için gerekli olan çok sayıda uykudan mahrum fareyi içeren özel çalışma tasarımları için, birden fazla cihazın paralel olarak çalışması gerektiğinde pahalı olabilirler. Öte yandan, su platformları ve nazik kullanım protokolleri, uyku yoksunluğunu indüklemek için yaygın olarak kullanılan daha ucuz ve daha basit yöntemlerdir. Bununla birlikte, su platformu, önceden belirlenmiş yoksunluk-dinlenme döngülerinin10,11 otomatik kontrolüne izin vermez ve nazik kullanım, araştırmacıların uykuyu bozmak için sürekli uyanık olmasını gerektirir. Ek olarak, dönen tamburlar gibi diğer yöntemler, sosyal izolasyon veya stres12 ile karıştırılabilir.

Orbital çalkalayıcı tabanlı yöntemden esinlenerek, farelerde uyku yoksunluğu için rocker platform tabanlı bir cihaz oluşturmak için bir protokol sunmayı amaçlıyoruz. Bu yöntem ucuz, etkili, minimum stresli, kontrol edilebilir ve otomatiktir. Mevcut protokol, erişilebilirliğimize bağlı olarak, yörünge çalkalayıcılardan yaklaşık on kat daha ucuz bir maliyetle rocker platform tabanlı bir cihaz oluşturmamıza izin veriyor. Bu cihaz, grup halinde barındırılan farelerde uykuyu etkili bir şekilde bozdu ve minimum stres tepkisi ile uyku yoksunluğunun karakteristik değişikliklerine neden oldu. Uyku yoksunluğunun çoklu hastalıkların patogenezi üzerindeki etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını araştırmakla ilgilenen araştırmacılar için, özellikle de çalışma paralel olarak çok gruplu uyku yoksunluğunu içerdiğinde, özellikle yararlı olacaktır.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan deney protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi Renji Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Refahı Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmada 8 ila 10 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Cihazı kurmak için gerekli ana parçalar Şekil 1A'da listelenmiştir.

1. Uyku yoksunluğu cihazının hazırlanması

  1. T şeklinde bir yapı oluşturmak için 50 cm'lik oluklu çelik kanalın bir ucunu 40 cm'lik oluklu çelik kanalın ortasına vidalarla sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın); işlemi tekrarlayın ve bu tür iki T şeklinde yapı yapın (Şekil 1B-a).
  2. T şeklindeki iki yapının 30 cm aralıklarla paralel olarak yukarı doğru durmasını sağlayın ve iki T şeklindeki yapının tabanlarını vidalar kullanarak 30 cm vida uyumlu bir çelik silindirle (bkz. Malzeme Tablosu) birleştirin (Şekil 1B-b).
  3. İki T şeklindeki yapı arasına çelik bir dikdörtgen platform (20 × 25 cm) (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin (Şekil 1B-c).
    NOT: Belirtilen boyutta kullanıma hazır çelik dikdörtgen platformlar mevcut değilse, 2 mm kalınlığındaki yassı çelikler kaynaklanarak yapılabilir.
  4. Platforma tutturulmuş 30 cm'lik vida uyumlu çelik silindirin her iki ucunu, üstten 10 cm aşağıda T şeklindeki yapıların her birine sabitlenmiş iki yatağa sabitleyin (Şekil 1B-d).
  5. Vidaları kullanarak üstten 25 cm aşağıda T şeklindeki yapılardan birine bir motor montajını (bkz. Malzeme Tablosu) sabitleyin (Şekil 1B-e).
    NOT: Alternatif olarak, motor montajını mürettebat yerine T şeklindeki yapıya sabitlemek için inşaat yapıştırıcısı kullanılabilir.
  6. Motor yuvasına vidalarla bir motor takın (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1B-f).
  7. Motorun altındaki T şeklindeki yapıya kendinden kilitli bantlarla bir soğutma fanı (bkz. Malzeme Tablosu) sabitleyin (Şekil 1B-g).
  8. Bir biyel kolunun yatak ucunu vidaları kullanarak motora bakan bir platform köşesine sabitleyin (Şekil 1B-h).
  9. Biyel kolunun diğer ucunu vidaları kullanarak motor miline sabitleyin (Şekil 1B-i).
  10. Bir elektrikli matkap kullanarak plastik bir kabın veya standart hayvan kafesinin dört köşesinin her birine 4 mm'lik iki adet 4 mm'lik delik açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve kafesin sol tarafında iki adet 4 mm'lik delik ve 6 mm'lik bir alt delik açın (Şekil 1B-j).
  11. Kafesi köşe deliklerinden kendinden kilitli bantlarla dikdörtgen platform üzerine sabitleyin (Şekil 1B-k).
  12. Elektrikli matkapla 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün kapağına 5 mm'lik bir delik açın ve su sızıntısını önlemek için deliği küresel vana ile donatılmış uzun bir nozulla kapatın.
    NOT: Su şişelerini özelleştirmek zorsa, hidrojel su temini için alternatif bir seçenek olacaktır.
  13. Özelleştirilmiş su şişesini, nozul 4 mm'lik delikten geçecek şekilde iki 6 mm'lik delikten kendinden kilitli bantlar kullanarak kafesin sol tarafına sabitleyin (Şekil 1B-l).
  14. Güç tuğlası adaptörünün çıkış elektrik kablolarını motorun iki terminaline bağlayın (Şekil 1B-l).
    NOT: Kabloları motor terminallerine bağlamak için belirli bir polarite gereksinimi yoktur.
  15. Güç tuğlası adaptörünün giriş elektrik kablolarını zaman kontaktörüne bağlayın (Şekil 1B-m).

2. Uyku yoksunluğunun indüksiyonu

  1. Zaman kontaktörünün sol ve sağ yarısındaki en sağdaki artı işareti düğmelerine basın (Malzeme Tablosuna bakın), her iki taraftaki mekanik sayaçlarda "M" görünene kadar sırasıyla (Şekil 1C-a).
  2. Zaman kontaktörünün sol ve sağ yarısındaki orta artı işareti düğmelerine, her iki taraftaki mekanik sayaçlarda "5M" görünene kadar basın (Şekil 1C-b).
  3. Sol mekanik sayaçta "15M" görünene kadar zaman kontaktörünün sol yarısındaki en soldaki artı işareti düğmesine basın (Şekil 1C-c).
    NOT: Zaman kontaktörü daha sonra döngüsel modda 15 dakika açık ve 5 dakika kapalı olacaktır.
  4. Fareleri su ve yiyecek ad libitum ile kafese koyun.
  5. Zaman kontaktörüne ve soğutma fanına güç sağlayın.
    NOT: Platform şimdi 10 rpm'de sallanacak.
  6. Her fareyi her gün Zeitgeber saati 0'da (ZT0) tartın.
    NOT: Işık sabah 8'den (ZT0) akşam 8'e (ZT12) kadar açıktır.

3. Oral glukoz tolerans testi

  1. Kuyruk damarlarından kan örneklemesi yaparak açlık farelerinde açlık glikoz seviyelerini ölçün.
  2. 1 mL şırınga kullanarak intraperitoneal olarak her fareye (2 g / kg vücut ağırlığı) glikoz çözeltisi enjekte edin.
  3. Kuyruk damarından kan örnekleri toplayın ve kan şekerini glikoz enjeksiyonundan sırasıyla 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakika sonra test edin.
  4. Testten sonra fareleri yiyecek ve su ad libitum ile kafese geri koyun.

4. Beyin dokularının toplanması

  1. Yeterli anesteziden sonra fareleri 3-5 dakika boyunca izoflurana (% 2) maruz bırakarak dekapite edin.
  2. Kafatasını ortaya çıkarın ve cerrahi makas kullanarak kafatasında 1 cm dikey bir kesim yapın.
  3. Beyin dokusunu ortaya çıkarmak için sivrisinek kanama durdurucuları kullanarak kafatasını çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Kavisli cımbız kullanarak tüm beyni yavaşça kraniyal boşluktan çıkarın.
    NOT: Beyin dokusu yerel politikalara göre çıkarılmalıdır.
  5. Beyin dokusunu soğuk fosfat tamponlu salin (1x PBS, 4 °C) kullanarak yıkayın.
  6. Sağlam beyin dokusunu sıvı nitrojen içinde dondurun ve uzun süreli depolama için dokuyu -80 ° C'ye aktarın.
    NOT: -80 ° C'de saklandığında, flaş donmuş beyin dokusu en az 6 ay boyunca stabildir.

5. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile gen ekspresyonunun saptanması

  1. Beyin dokularını 4 °C'de veya buz üzerinde çözdürün.
  2. Dokuyu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve TRIzol bazlı yöntemi kullanarak toplam RNA'yı çıkarın13.
  3. RNA ekstraksiyonundan sonra bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Ticari bir kit14 kullanarak toplam RNA'nın (1 μg) tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters transkripsiyonunu gerçekleştirin.
  5. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile gen ekspresyon seviyelerini ölçün15.

Sonuçlar

Farelerde uyku yoksunluğu için kurulan cihaz Şekil 1D'de gösterilmektedir. Uyku yoksunluğunun başlamasından sonraki 7. günde, elektroensefalogram (EEG) ve elektromiyografi (EMG) izleme16, cihazın farelerde uyku süresini önemli ölçüde azalttığını ve uyanıklık süresini artırdığını göstermiştir (Şekil 2A-D). Bu arada, mevcut protokol, başarılı uyku yoksunluğunun belirteçleri...

Tartışmalar

Uyku yoksunluğunun fare modelleri, uyku bozukluğunun kardiyovasküler hastalık21, psikiyatrik durumlar22 ve nörolojik bozukluklar23 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerindeki etkilerini incelemek için gereklidir. Farelerde mevcut uyku yoksunluğu stratejileri arasında, tekrarlayan kısa süreli uyku kesintisini içeren fiziksel yaklaşımlar en sık kullanılanlardır 5,7,12<...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82230014, 81930007, 82270342), Şanghay Üstün Akademik Liderler Programı (18XD1402400), Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), Şanghay Pujiang Yetenek Programı (2020PJD030), SHWSRS(2023-62), Şanghay Yaşlanma ve Tıp Klinik Araştırma Merkezi (19MC1910500) ve Bengbu Tıp Fakültesi Lisansüstü İnovasyon Programı (Byycxz21075).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C-S
50 mL centrifuge tubeNEST602002
Adenosine ELISA kitRuifan technologyRF8885
Animal cageZeYa techMJ2
Blood glucose meterYuYue580
C57BL/6J MiceJieSiJie Laboratory AnimalN/AAge: 8-10 weeks
Connecting rodShengXiang TechN/ALength:  20 cm
Cooling fanLiMingEFB0805VHSupply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kitElabscienceE-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis systemPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluraneRWD20071302
mosquito hemostatsFST13011-12Surgical instrument
Motor and motor mountMingYangMY36GP-555Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Power brick adapterMingYangQiYe-0243Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kitVazymeQ711-02
qPCR measurement equipmentRoche480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinderCustomizedN/AWidth: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kitVazymeR323-01
Screw and nutGuwanjiN/AInner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinderCustomizedN/ALength: 300 mm
Slotted steel channelsCustomizedN/ALength: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactorLiXiangDH48S-SSupply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzolVazymeR401-01

Referanslar

  1. Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292 (2023).
  2. Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
  3. Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
  4. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  5. Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90 (2019).
  6. Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
  7. Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
  8. Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35 (2022).
  9. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  10. Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
  11. Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559 (2016).
  12. Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
  13. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  14. Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
  15. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  16. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
  17. Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
  18. Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
  19. Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
  20. Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
  21. Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
  22. Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430 (2014).
  23. Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017 (2020).
  24. Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
  25. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  26. Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Farelerde Uyku Yoksunlu u CihazSirkadiyen Ritim BozulmasUyku Yoksunlu u Y ntemleriUyku Yoksunlu unu nd kleme Y ntemleriOtomatik Rocker Platform Tabanl CihazAyarlanabilir Zaman Aral klarMinimum Stres TepkisiUyku Yoksunlu unun Sa l k zerindeki Etkilerioklu Hastal klar n Patogenezi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır