Estabelecendo um dispositivo para privação de sono em camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve um método para a criação de um dispositivo baseado em plataforma rocker de baixo custo, usado para induzir privação de sono em camundongos. Esse dispositivo tem se mostrado eficaz em causar interrupções nos padrões de sono evidenciados pelo eletroencefalograma (EEG), bem como induzir alterações metabólicas e moleculares associadas à privação de sono.

Resumo

A ruptura do ritmo circadiano refere-se à dessincronização entre o ambiente ou comportamento externo e o relógio molecular endógeno, que prejudica significativamente a saúde. A privação do sono é uma das causas mais comuns de interrupção do ritmo circadiano. Várias modalidades (por exemplo, plataformas na água, manuseio suave, câmaras de barra deslizante, tambores giratórios, agitadores orbitais, etc.) foram relatadas para induzir privação de sono em camundongos para investigar seus efeitos na saúde. O presente estudo introduz um método alternativo para a privação de sono em camundongos. Um dispositivo automatizado baseado em plataforma rocker foi projetado que é econômico e interrompe eficientemente o sono em ratos alojados em grupo em intervalos de tempo ajustáveis. Esse dispositivo induz alterações características de privação de sono com mínima resposta ao estresse. Consequentemente, este método pode ser útil para investigadores interessados em estudar os efeitos e mecanismos subjacentes da privação de sono na patogênese de múltiplas doenças. Além disso, oferece uma solução econômica, particularmente quando vários dispositivos de privação de sono são necessários para funcionar em paralelo.

Introdução

A ruptura do ritmo circadiano refere-se à dessincronização entre o ambiente ou comportamento externo e o relógio biológico endógeno. Uma das causas mais comuns de perturbação do ritmo circadiano é a privação de sono¹. A privação do sono não só afeta negativamente a saúde humana, mas também aumenta significativamente o risco de muitas doenças, incluindo câncer² e doenças cardiovasculares³. No entanto, os mecanismos subjacentes aos efeitos prejudiciais da privação de sono permanecem em grande parte desconhecidos, e o estabelecimento de modelos de privação de sono é essencial para melhorar nossa compreensão a esse respeito.

Vários métodos para privação de sono em camundongos têm sido relatados, como o uso de plataformas de água⁴, manuseio suave⁵, câmaras de barra deslizante⁶, tambores rotativos⁷ e protocolos de agitação em gaiola ^5,8,9. As câmaras de barras deslizantes varrem automaticamente as barras pelo fundo da gaiola, forçando os ratos a caminhar sobre elas e permanecer acordados. Os protocolos de agitação da gaiola envolvem a colocação de gaiolas em agitadores orbitais de laboratório, resultando em uma interrupção eficiente do sono. Embora esses métodos sejam automáticos e eficazes, eles podem ser caros quando vários dispositivos são necessários para funcionar em paralelo, especialmente para desenhos de estudo específicos que envolvem um grande número de camundongos privados de sono necessários para o perfil genético circadiano. Por outro lado, plataformas de água e protocolos de manuseio suave são métodos mais baratos e simples comumente usados para induzir a privação de sono. No entanto, a plataforma de água não permite o controle automático de ciclos de privação-repouso pré-especificados^10,11, e o manuseio suave requer vigilância contínua dos pesquisadores para perturbar o sono. Além disso, outras modalidades, como tambores rotativos, podem ser confundidas pelo isolamento social ou estresse¹².

Inspirados no método baseado em agitador orbital, pretendemos introduzir um protocolo para estabelecer um dispositivo baseado em plataforma rocker para privação de sono em camundongos. Este método é barato, eficaz, minimamente estressante, controlável e automatizado. O protocolo atual nos permite criar um dispositivo baseado em plataforma rocker a um custo aproximadamente dez vezes mais barato do que o de agitadores orbitais, com base em nossa acessibilidade. Este dispositivo efetivamente interrompeu o sono em camundongos alojados em grupo e induziu mudanças características de privação de sono com resposta mínima ao estresse. Será especialmente útil para pesquisadores interessados em investigar os efeitos e mecanismos subjacentes da privação de sono na patogênese de múltiplas doenças, particularmente quando o estudo envolve privação de sono em múltiplos grupos em paralelo.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética de Bem-Estar Animal de Laboratório do Hospital Renji, Faculdade de Medicina, Shanghai Jiao Tong University. Camundongos C57BL/6J machos, com idade entre 8 e 10 semanas, foram utilizados no estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). As principais partes necessárias para estabelecer o dispositivo estão listadas na Figura 1A.

1. Preparo do dispositivo de privação de sono

1. Fixe uma extremidade de um canal de aço ranhurado de 50 cm no meio de um canal de aço ranhurado de 40 cm com parafusos (ver Tabela de Materiais) para fazer uma estrutura em forma de T; repetir o processo e fazer duas dessas estruturas em forma de T (Figura 1B-a).
2. Faça com que as duas estruturas em forma de T fiquem para cima paralelamente a 30 cm de distância e conecte os fundos das duas estruturas em forma de T com um cilindro de aço compatível com parafusos de 30 cm (consulte a Tabela de Materiais) usando parafusos (Figura 1B-b).
3. Coloque uma plataforma retangular de aço (20 × 25 cm) (ver Tabela de Materiais) entre as duas estruturas em forma de T (Figura 1B-c).
   NOTA: Se plataformas de retângulo de aço prontas para uso do tamanho especificado não estiverem disponíveis, pode-se fazer uma soldando aços planos de 2 mm de espessura.
4. Fixe cada extremidade de um cilindro de aço compatível com parafuso de 30 cm fixado na plataforma a dois rolamentos fixados em cada uma das estruturas em forma de T a 10 cm abaixo do topo (Figura 1B-d).
5. Fixe um suporte de motor (ver Tabela de Materiais) em uma das estruturas em forma de T a 25 cm para baixo do topo usando parafusos (Figura 1B-e).
   NOTA: Alternativamente, o adesivo de construção pode ser usado para fixar a montagem do motor na estrutura em forma de T em vez de tripulações.
6. Instale um motor (consulte Tabela de Materiais) no suporte do motor com parafusos (Figura 1B-f).
7. Fixe um ventilador de resfriamento (consulte a Tabela de Materiais) com bandas autotravantes na estrutura em forma de T abaixo do motor (Figura 1B-g).
8. Fixe a extremidade do rolamento de uma biela em um canto da plataforma voltado para o motor usando parafusos (Figura 1B-h).
9. Fixe outra extremidade da biela no eixo do motor com parafusos (Figura 1B-i).
10. Faça dois furos de 4 mm em cada um dos quatro cantos de um recipiente plástico ou gaiola de animais padrão (ver Tabela de Materiais) usando uma furadeira elétrica e faça dois furos de 4 mm e um furo inferior de 6 mm no lado esquerdo da gaiola (Figura 1B-j).
11. Fixe a gaiola na plataforma do retângulo com bandas autotravantes através dos orifícios de canto (Figura 1B-k).
12. Faça um furo de 5 mm na tampa de um tubo centrífugo de 50 mL com uma furadeira elétrica e pampe o orifício com um bocal longo equipado com uma válvula de esfera para evitar vazamento de água.
    NOTA: O hidrogel seria uma opção alternativa para o abastecimento de água se a personalização de garrafas de água for difícil.
13. Fixe a garrafa de água personalizada no lado esquerdo da gaiola usando faixas autoblocantes através dos dois orifícios de 4 mm, com o bocal passando pelo orifício de 6 mm (Figura 1B-l).
14. Conecte os fios elétricos de saída do adaptador de bloco de alimentação aos dois terminais do motor (Figura 1B-l).
    NOTA: Não há nenhum requisito específico de polaridade para conectar os fios aos terminais do motor.
15. Conecte os fios elétricos de entrada do adaptador de bloco de alimentação ao contator de tempo (Figura 1B-m).

2. Indução da privação de sono

1. Pressione os botões de sinal de mais à direita nas metades esquerda e direita do contator de tempo (consulte Tabela de Materiais), respectivamente, até que "M" apareça nos contadores mecânicos de ambos os lados (Figura 1C-a).
2. Pressione os botões de sinal de adição do meio nas metades esquerda e direita do contator de tempo até que "5M" apareça nos contadores mecânicos de ambos os lados (Figura 1C-b).
3. Pressione o botão de sinal de adição mais à esquerda na metade esquerda do contator de tempo até que "15M" apareça no contador mecânico esquerdo (Figura 1C-c).
   NOTA: O contator de tempo ficará ligado por 15 min e desligado por 5 min em um modo cíclico.
4. Coloque ratos na gaiola com água e comida ad libitum.
5. Forneça energia ao contator de tempo e ao ventilador de resfriamento.
   NOTA: A plataforma agora estará balançando a 10 rpm.
6. Pese cada rato no Zeitgeber time 0 (ZT0) todos os dias.
   NOTA: A luz está acesa das 8h (ZT0) às 20h (ZT12).

3. Teste oral de tolerância à glicose

1. Medir os níveis de glicose em jejum em camundongos em jejum coletando sangue das veias da cauda.
2. Injetar solução de glicose em cada rato (2 g/kg de peso corporal) por via intraperitoneal utilizando seringas de 1 ml.
3. Coletar amostras de sangue através da veia da cauda e testar a glicose no sangue em 15 min, 30 min, 60 min e 120 min após a injeção de glicose, respectivamente.
4. Coloque os ratos de volta na gaiola com a comida e água ad libitum após o teste.

4. Colheita dos tecidos cerebrais

1. Decapitar os camundongos após anestesia adequada, expondo-os ao isoflurano (2%) por 3-5 min.
2. Expor o crânio e fazer um corte vertical de 1 cm no crânio usando tesoura cirúrgica.
3. Remova o crânio usando hemostáticos de mosquito (ver Tabela de Materiais) para expor o tecido cerebral.
4. Mova suavemente todo o cérebro para fora da cavidade craniana usando pinças curvas.
   NOTA: O tecido cerebral deve ser removido de acordo com as políticas locais.
5. Lavar o tecido cerebral com solução salina tamponada com fosfato frio (1x PBS, 4 °C).
6. Congelar rapidamente o tecido cerebral intacto em nitrogênio líquido e transferir o tecido para -80 °C para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: Quando armazenado a -80°C, o tecido cerebral congelado pelo flash é estável por pelo menos 6 meses.

5. Detecção da expressão gênica pela reação em cadeia da polimerase (PCR)

1. Descongelar os tecidos cerebrais a 4 °C ou no gelo.
2. Transferir o tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e extrair o RNA total usando o método baseado em TRIzol¹³.
3. Medir a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais) após a extração de RNA.
4. Realizar a transcrição reversa do RNA total (1 μg) em DNA complementar (cDNA) utilizando um kit comercial¹⁴.
5. Medir os níveis de expressão gênica por meio da reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real¹⁵.

Resultados

O dispositivo estabelecido para privação de sono em camundongos é mostrado na Figura 1D. No 7º dia após o início da privação de sono, a monitorização com eletroencefalograma (EEG) e eletromiografia (EMG)¹⁶ indicou que o dispositivo reduziu significativamente a duração do sono e aumentou a duração da vigília em camundongos (Figura 2A-D). Enquanto isso, o protocolo atual aumentou significativ...

Discussão

Modelos murinos de privação de sono são essenciais para estudar os efeitos da interrupção do sono em várias doenças, incluindo doenças cardiovasculares²¹, condições psiquiátricas²² e distúrbios neurológicos²³. Dentre as estratégias de privação de sono existentes em camundongos, as abordagens físicas que envolvem interrupção repetitiva do sono em curto prazo são as mais comumente^{utilizadas5,7,12}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
50 mL centrifuge tube	NEST	602002
Adenosine ELISA kit	Ruifan technology	RF8885
Animal cage	ZeYa tech	MJ2
Blood glucose meter	YuYue	580
C57BL/6J Mice	JieSiJie Laboratory Animal	N/A	Age: 8-10 weeks
Connecting rod	ShengXiang Tech	N/A	Length:  20 cm
Cooling fan	LiMing	EFB0805VH	Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kit	Elabscience	E-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis system	Pinnacle Technology	8200-K1-iSE3
Isoflurane	RWD	20071302
mosquito hemostats	FST	13011-12	Surgical instrument
Motor and motor mount	MingYang	MY36GP-555	Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c
Power brick adapter	MingYang	QiYe-0243	Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kit	Vazyme	Q711-02
qPCR measurement equipment	Roche	480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kit	Vazyme	R323-01
Screw and nut	Guwanji	N/A	Inner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Length: 300 mm
Slotted steel channels	Customized	N/A	Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactor	LiXiang	DH48S-S	Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzol	Vazyme	R401-01