建立小鼠睡眠剥夺装置

摘要

本方案概述了一种用于建立用于诱导小鼠睡眠剥夺的基于摇杆平台的具有成本效益的摇杆平台的装置的方法。该设备已被证明可有效导致脑电图 （EEG） 证明的睡眠模式中断，以及诱导与睡眠剥夺相关的代谢和分子变化。

摘要

昼夜节律紊乱是指外部环境或行为与内源性分子钟不同步，严重损害健康。睡眠不足是昼夜节律紊乱的最常见原因之一。据报道，各种方式（例如，水上平台、轻柔处理、滑动杆室、旋转鼓、轨道振动器等）可诱导小鼠睡眠剥夺，以研究其对健康的影响。目前的研究引入了一种小鼠睡眠剥夺的替代方法。设计了一种基于自动摇杆平台的设备，该设备具有成本效益，并且可以在可调节的时间间隔内有效地扰乱群居小鼠的睡眠。该装置以最小的应激反应诱导睡眠剥夺的特征性变化。因此，这种方法可能对有兴趣研究睡眠剥夺对多种疾病发病机制的影响和潜在机制的研究人员有用。此外，它还提供了一种经济高效的解决方案，特别是当需要多个睡眠剥夺设备并行运行时。

引言

昼夜节律紊乱是指外部环境或行为与内源性生物钟之间的不同步。昼夜节律紊乱的最常见原因之一是睡眠剥夺¹.睡眠不足不仅会对人类健康产生负面影响，还会显着增加患多种疾病的风险，包括癌症² 和心血管疾病³。然而，睡眠剥夺的有害影响背后的机制在很大程度上仍然未知，建立睡眠剥夺模型对于加强我们在这方面的理解至关重要。

已经报道了各种剥夺小鼠睡眠的方法，例如使用水平台⁴，轻柔处理⁵，滑动杆室⁶，旋转鼓⁷和笼式搅拌协议^5,8,9。滑动杆室自动扫过笼子底部的杆，迫使老鼠走过它们并保持清醒。笼子搅拌方案包括将笼子放在实验室轨道振动器上，从而有效地中断睡眠。虽然这些方法是自动且有效的，但当需要多个设备并行运行时，它们可能会很昂贵，特别是对于涉及昼夜节律基因分析所需的大量睡眠不足小鼠的特定研究设计。另一方面，水平台和温和的处理方案是通常用于诱导睡眠剥夺的更便宜、更简单的方法。然而，水平台不允许自动控制预先指定的剥夺-休息周期^10,11，并且轻柔的处理需要研究人员持续保持警惕以扰乱睡眠。此外，其他方式，如旋转鼓，可能会因社会孤立或压力^{而混淆 12}.

受基于轨道振荡器的方法的启发，我们旨在引入一种协议，用于建立基于摇臂平台的小鼠睡眠剥夺装置。这种方法便宜、有效、压力最小、可控且自动化。根据我们的可访问性，当前的协议允许我们以比轨道振动器便宜约十倍的成本创建基于摇杆平台的设备。该装置有效地扰乱了群居小鼠的睡眠，并以最小的应激反应诱导了睡眠剥夺的特征性变化。对于有兴趣研究睡眠剥夺对多种疾病发病机制的影响和潜在机制的研究人员来说，这将特别有用，特别是当该研究同时涉及多组睡眠剥夺时。

研究方案

本研究所有动物实验方案均获得上海交通大学医学院仁济医院实验动物福利伦理委员会批准。该研究使用了年龄在8至10周之间的雄性C57BL / 6J小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。 图1A列出了建立设备所需的主要部件。

1.睡眠剥夺装置的制备

1. 用螺钉将 50 cm 开槽钢槽的一端固定在 40 cm 开槽钢槽的中间（见材料表），制成 T 形结构;重复该过程并制作两个这样的T形结构（图1B-a）。
2. 使两个 T 形结构平行向上站立 30 厘米，并使用螺钉将两个 T 形结构的底部与 30 厘米的螺钉兼容钢圆柱体（见材料表）连接（图 1B-b）。
3. 在两个 T 形结构之间放置一个钢制矩形平台（20 × 25 厘米）（见材料表）（图 1B-c）。
   注意: 如果没有指定尺寸的即用型钢矩形平台，可以通过焊接 2 毫米厚的扁钢来制作一个。
4. 将连接到平台中的 30 厘米螺钉兼容钢圆柱体的两端固定在距离顶部 10 厘米处的每个 T 形结构上的两个轴承上（图 1B-d）。
5. 使用螺钉将电机安装座（参见材料表）固定在距顶部 25 厘米处的 T 形结构之一上（图 1B-e）。
   注意: 或者，可以使用建筑粘合剂将电机安装座固定在 T 形结构上，而不是机组人员上。
6. 用螺钉在电机支架上安装电机（参见材料表）（图 1B-f）。
7. 在电机下方的 T 形结构上用自锁带固定冷却风扇（参见材料表）（图 1B-g）。
8. 使用螺钉将连杆的轴承端固定到面向电机的平台角上（图 1B-h）。
9. 使用螺钉将连杆的另一端固定到电机的轴上（图 1B-i）。
10. 使用电钻在塑料容器或标准动物笼子的四个角上钻两个 4 毫米的孔（见材料表），并在笼子左侧钻两个 4 毫米的孔和一个较低的 6 毫米孔（图 1B-j）。
11. 用自锁带通过角孔将笼子固定在矩形平台上（图 1B-k）。
12. 用电钻在 50 mL 离心管的盖子上钻一个 5 mm 的孔，然后用装有球阀的长喷嘴插入孔，以防止漏水。
    注意:如果定制水瓶很困难，水凝胶将是供水的替代选择。
13. 使用自锁带将定制的水瓶固定在笼子的左侧，穿过两个 4 毫米的孔，喷嘴穿过 6 毫米的孔（图 1B-l）。
14. 将电源砖适配器的输出电线连接到电机的两个端子（图 1B-l）。
    注意: 将电线连接到电机端子没有特定的极性要求。
15. 将电源模块适配器的输入电线连接到时间接触器（图 1B-m）。

2.诱导睡眠剥夺

1. 分别按下时间接触器左半部分和右半部分的最右边加号按钮（参见材料表），直到两侧的机械计数器上出现"M"（图 1C-a）。
2. 按下时间接触器左右两半的中间加号按钮，直到两侧的机械计数器上出现"5M"（图 1C-b）。
3. 按下时间接触器左半部分最左边的加号按钮，直到左侧机械计数器上出现"15M"（图 1C-c）。
   注意: 然后，时间接触器将在循环模式下打开 15 分钟并关闭 5 分钟。
4. 随意将小鼠放入笼子中，并随意喝水和食物。
5. 为时间接触器和冷却风扇供电。
   注意: 平台现在将以 10 rpm 的速度摇摆。
6. 每天在Zeitgeber时间0（ZT0）称量每只小鼠。
   注意: 灯从上午 8 点 （ZT0） 到晚上 8 点 （ZT12） 亮着。

3.口服葡萄糖耐量试验

1. 通过从尾静脉取样血液来测量空腹小鼠的空腹血糖水平。
2. 使用1mL注射器腹膜内注射葡萄糖溶液到每只小鼠（2g / kg体重）中。
3. 通过尾静脉采集血样，分别在葡萄糖注射后15分钟、30分钟、60分钟和120分钟检测血糖。
4. 测试后，将小鼠放回笼子里，随意喂食和喝水。

4. 收获脑组织

1. 在充分麻醉后将小鼠暴露于异氟烷（2%）3-5分钟，将其斩首。
2. 露出头骨，用手术剪刀在头骨上垂直切开 1 厘米。
3. 使用蚊子止血器（见 材料表）去除颅骨以暴露脑组织。
4. 使用弯曲的镊子轻轻地将整个大脑移出颅腔。
   注意:应根据当地政策切除脑组织。
5. 使用冷磷酸盐缓冲盐水（1x PBS，4°C）洗涤脑组织。
6. 将完整的脑组织在液氮中快速冷冻，并将组织转移到-80°C进行长期储存。
   注意:当储存在 -80°C 下时，速冻脑组织可稳定至少 6 个月。

5. 聚合酶链反应（PCR）检测基因表达

1. 在4°C或冰上解冻脑组织。
2. 将组织转移到 1.5 mL 微量离心管中，并使用基于 TRIzol 的方法提取总 RNA¹³。
3. RNA提取后，使用分光光度计测量RNA的浓度（参见 材料表）。
4. 使用商业试剂盒¹⁴ 将总 RNA （1 μg） 逆转录为互补 DNA （cDNA）。
5. 通过实时逆转录聚合酶链反应测量基因表达水平¹⁵.

结果

图1D显示了用于小鼠睡眠剥夺的既定装置。在睡眠剥夺开始后的第 7 天，脑电图 （EEG） 和肌电图 （EMG） 监测¹⁶ 表明该装置显着缩短了小鼠的睡眠持续时间并增加了清醒持续时间（图 2A-D）。同时，目前的方案显着增加了大脑中 Homer1a 的腺苷积聚和 mRNA 水平（图 2E，F?...

讨论

睡眠剥夺的小鼠模型对于研究睡眠中断对各种疾病的影响至关重要，包括心血管疾病²¹、精神疾病²² 和神经系统疾病²³。在小鼠现有的睡眠剥夺策略中，涉及重复短期睡眠中断的物理方法是最常用^的5,7,12。这些物理方法包括使用水平台⁴、轻柔处理

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
50 mL centrifuge tube	NEST	602002
Adenosine ELISA kit	Ruifan technology	RF8885
Animal cage	ZeYa tech	MJ2
Blood glucose meter	YuYue	580
C57BL/6J Mice	JieSiJie Laboratory Animal	N/A	Age: 8-10 weeks
Connecting rod	ShengXiang Tech	N/A	Length:  20 cm
Cooling fan	LiMing	EFB0805VH	Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kit	Elabscience	E-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis system	Pinnacle Technology	8200-K1-iSE3
Isoflurane	RWD	20071302
mosquito hemostats	FST	13011-12	Surgical instrument
Motor and motor mount	MingYang	MY36GP-555	Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c
Power brick adapter	MingYang	QiYe-0243	Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kit	Vazyme	Q711-02
qPCR measurement equipment	Roche	480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kit	Vazyme	R323-01
Screw and nut	Guwanji	N/A	Inner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Length: 300 mm
Slotted steel channels	Customized	N/A	Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactor	LiXiang	DH48S-S	Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzol	Vazyme	R401-01