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요약

본 프로토콜은 마우스에서 수면 박탈을 유도하기 위해 사용되는 비용 효율적인 로커 플랫폼 기반 장치를 설정하는 방법을 개략적으로 설명합니다. 이 장치는 뇌전도(EEG)로 입증된 수면 패턴에 혼란을 일으키고 수면 부족과 관련된 대사 및 분자 변화를 유도하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다.

초록

일주기 리듬 교란은 외부 환경 또는 행동과 내인성 분자 시계 사이의 비동기화를 말하며, 이는 건강을 크게 손상시킵니다. 수면 부족은 일주기 리듬 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 다양한 양식(예: 물 위의 플랫폼, 부드러운 취급, 슬라이딩 바 챔버, 회전 드럼, 궤도 셰이커 등)이 건강에 미치는 영향을 조사하기 위해 쥐의 수면 부족을 유도하는 것으로 보고되었습니다. 이번 연구는 생쥐의 수면 부족에 대한 대체 방법을 소개합니다. 자동화된 로커 플랫폼 기반 장치는 비용 효율적이며 조정 가능한 시간 간격으로 그룹 수용 마우스의 수면을 효율적으로 방해하도록 설계되었습니다. 이 장치는 최소한의 스트레스 반응으로 수면 부족의 특징적인 변화를 유도합니다. 결과적으로, 이 방법은 수면 부족이 여러 질병의 발병 기전에 미치는 영향과 근본적인 메커니즘을 연구하는 데 관심이 있는 조사관에게 유용할 수 있습니다. 또한 특히 여러 수면 부족 장치를 병렬로 실행해야 하는 경우 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

서문

일주기 리듬 교란은 외부 환경 또는 행동과 내인성 생체 시계 사이의 비동기화를 말합니다. 일주기 리듬 장애의 가장 흔한 원인 중 하나는 수면 부족이다1. 수면 부족은 인체 건강에 부정적인 영향을 미칠 뿐만 아니라 암2 및 심혈관 질환3을 포함한 많은 질병의 위험을 크게 증가시킨다. 그러나 수면 부족의 해로운 영향의 기저에 있는 메커니즘은 아직 거의 알려져 있지 않으며, 수면 부족 모델을 확립하는 것은 이와 관련하여 우리의 이해를 높이는 데 필수적입니다.

생쥐의 수면 박탈을 위한 다양한 방법들이 보고되었는데, 예를 들어 물 플랫폼(water platform)4, 부드러운 취급(gentle handling)5, 슬라이딩 바 챔버(sliding bar chamber)6, 회전 드럼(rotating drum)7, 케이지 교반 프로토콜(cage agitation protocol)5,8,9의 사용이 있다. 슬라이딩 바 챔버는 케이지 바닥을 가로질러 자동으로 바를 쓸어 쥐가 그 위를 걸어 다니며 깨어 있도록 합니다. 케이지 교반 프로토콜에는 실험실 궤도 셰이커에 케이지를 배치하여 효율적인 수면 방해를 초래하는 것이 포함됩니다. 이러한 방법은 자동적이고 효과적이지만, 특히 일주기 유전자 프로파일링에 필요한 많은 수의 수면 부족 마우스를 포함하는 특정 연구 설계의 경우 여러 장치를 병렬로 실행해야 하는 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 반면에, 물 플랫폼과 부드러운 취급 프로토콜은 수면 부족을 유도하는 데 일반적으로 사용되는 더 저렴하고 간단한 방법입니다. 그러나, 물 플랫폼은 미리 지정된 박탈-휴식 주기(10,11)의 자동 제어를 허용하지 않으며, 부드러운 취급은 수면을 방해하기 위해 연구원의 지속적인 경계가 필요합니다. 또한, 드럼 회전과 같은 다른 양상은 사회적 고립이나 스트레스로 인해 혼란스러울 수 있다12.

궤도 셰이커 기반 방법에서 영감을 받아 생쥐의 수면 부족을 위한 로커 플랫폼 기반 장치를 구축하기 위한 프로토콜을 도입하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 저렴하고 효과적이며 스트레스가 적고 제어 가능하며 자동화되어 있습니다. 현재 프로토콜은 접근성을 기반으로 궤도 셰이커보다 약 10배 저렴한 비용으로 로커 플랫폼 기반 장치를 만들 수 있습니다. 이 장치는 집단 수용 쥐의 수면을 효과적으로 방해하고 최소한의 스트레스 반응으로 수면 부족의 특징적인 변화를 유도했습니다. 수면 부족이 여러 질병의 발병 기전에 미치는 영향과 근본적인 메커니즘을 조사하는 데 관심이 있는 연구자, 특히 연구가 여러 그룹의 수면 부족을 병행하는 경우 특히 유용할 것입니다.

프로토콜

이 연구의 모든 동물 실험 프로토콜은 상하이 자오퉁 대학교 의과대학 렌지 병원의 실험실 동물 복지 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 8주에서 10주 사이의 수컷 C57BL/6J 마우스가 연구에 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 장치를 설정하는 데 필요한 주요 부품은 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 수면 박탈 장치 준비

  1. 50cm 홈이 있는 강철 채널의 한쪽 끝을 나사(재료 표 참조)로 나사(재료 표 참조)로 고정하여 T자형 구조를 만듭니다. 이 과정을 반복하여 두 개의 T자형 구조를 만듭니다(그림 1B-a).
  2. 두 개의 T자형 구조물을 위쪽으로 30cm 평행하게 세우고 나사를 사용하여 두 T자형 구조물의 바닥을 30cm 나사 호환 강철 실린더(재료 표 참조)로 연결합니다(그림 1B-b).
  3. 두 개의 T자형 구조물 사이에 강철 직사각형 플랫폼(20 × 25cm)(재료 표 참조)을 놓습니다(그림 1B-c).
    알림: 지정된 크기의 즉시 사용할 수 있는 강철 직사각형 플랫폼을 사용할 수 없는 경우 2mm 두께의 평강을 용접하여 만들 수 있습니다.
  4. 플랫폼에 부착된 30cm 나사 호환 강철 실린더의 각 끝을 상단에서 10cm 아래로 각 T자형 구조물에 고정된 두 개의 베어링에 고정합니다(그림 1B-d).
  5. 나사를 사용하여 상단에서 25cm 아래에 있는 T자형 구조물 중 하나에 모터 마운트(재료 표 참조)를 고정합니다(그림 1B-e).
    알림: 또는 건축용 접착제를 사용하여 승무원 대신 T자형 구조물에 모터 마운트를 고정할 수 있습니다.
  6. 나사를 사용하여 모터 마운트에 모터(재료 표 참조)를 설치합니다(그림 1B-f).
  7. 모터 아래의 T자형 구조에 자동 잠금 밴드가 있는 냉각 팬(재료 표 참조)을 고정합니다(그림 1B-g).
  8. 나사를 사용하여 커넥팅 로드의 베어링 끝을 모터를 향한 플랫폼 모서리에 고정합니다(그림 1B-h).
  9. 나사를 사용하여 커넥팅 로드의 다른 쪽 끝을 모터 샤프트에 고정합니다(그림 1B-i).
  10. 전기 드릴을 사용하여 플라스틱 용기 또는 표준 동물 케이지(재료 표 참조)의 네 모서리 각각에 두 개의 4mm 구멍을 뚫고 케이지 왼쪽에 두 개의 4mm 구멍과 더 낮은 6mm 구멍을 뚫습니다(그림 1B-j).
  11. 모서리 구멍을 통해 자동 잠금 밴드를 사용하여 직사각형 플랫폼에 케이지를 고정합니다(그림 1B-k).
  12. 50mL 원심 분리 튜브의 캡에 전기 드릴로 5mm의 구멍을 뚫고 볼 밸브가 장착 된 긴 노즐로 구멍을 꽂아 누수를 방지합니다.
    알림: 하이드로겔은 물병 사용자 정의가 어려운 경우 물 공급을 위한 대체 옵션이 될 것입니다.
  13. 노즐이 6mm 구멍을 통과하도록 하여 두 개의 4mm 구멍을 통해 자동 잠금 밴드를 사용하여 케이지 왼쪽에 맞춤형 물병을 고정합니다(그림 1B-l).
  14. 전원 브릭 어댑터의 출력 전선을 모터의 두 단자에 연결합니다(그림 1B-l).
    알림: 전선을 모터 단자에 연결하기 위한 특정 극성 요구 사항은 없습니다.
  15. 전원 브릭 어댑터의 입력 전선을 시간 접촉기에 연결합니다(그림 1B-m).

2. 수면 부족 유도

  1. 양쪽의 기계식 카운터에 "M"이 나타날 때까지 시간 접촉기의 왼쪽 및 오른쪽 절반에 있는 가장 오른쪽 더하기 기호 버튼(재료 표 참조)을 각각 누릅니다(그림 1C-a).
  2. 양쪽의 기계식 카운터에 "5M"이 나타날 때까지 시간 접촉기의 왼쪽과 오른쪽 절반에 있는 중간 더하기 기호 버튼을 누릅니다(그림 1C-b).
  3. 왼쪽 기계식 카운터에 "15M"이 나타날 때까지 시간 접촉기의 왼쪽 절반에 있는 더하기 기호 버튼을 누릅니다(그림 1C-c).
    알림: 그런 다음 시간 접촉기는 순환 모드에서 15분 동안 켜져 있고 5분 동안 꺼집니다.
  4. 쥐를 물과 음식이 있는 케이지에 넣으십시오.
  5. 시간 접촉기와 냉각 팬에 전원을 공급하십시오.
    알림: 이제 플랫폼이 10rpm으로 흔들립니다.
  6. 매일 Zeitgeber 시간 0(ZT0)에 각 마우스의 무게를 측정합니다.
    알림: 표시등은 오전 8시(ZT0)부터 오후 8시(ZT12)까지 켜집니다.

3. 경구 내당능 검사

  1. 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 공복 생쥐의 공복 포도당 수치를 측정합니다.
  2. 1mL 주사기를 사용하여 각 마우스(체중 2g/kg)에 1mL 주사기를 복강 내로 포도당 용액을 주입합니다.
  3. 꼬리 정맥을 통해 혈액 샘플을 채취하고 포도당 주입 후 각각 15분, 30분, 60분, 120분에 혈당을 테스트합니다.
  4. 실험 후 생쥐를 음식과 물과 함께 케이지에 다시 넣으십시오.

4. 뇌 조직 채취

  1. 적절한 마취 후 쥐를 3-5분 동안 이소플루란(2%)에 노출시켜 목을 베십시오.
  2. 두개골을 노출시키고 수술용 가위를 사용하여 두개골을 1cm 수직으로 자릅니다.
  3. 모기 지혈제( 재료 표 참조)를 사용하여 두개골을 제거하여 뇌 조직을 노출시킵니다.
  4. 구부러진 핀셋을 사용하여 뇌 전체를 두개강 밖으로 부드럽게 움직입니다.
    참고: 뇌 조직은 현지 정책에 따라 제거해야 합니다.
  5. 차가운 인산염 완충 식염수(1x PBS, 4°C)를 사용하여 뇌 조직을 세척합니다.
  6. 온전한 뇌 조직을 액체 질소에 얼린 후 장기 보관을 위해 -80°C로 옮깁니다.
    알림: -80°C에서 보관하면 급속 냉동 뇌 조직은 최소 6개월 동안 안정적입니다.

5. 중합효소연쇄반응(PCR)에 의한 유전자 발현 검출

  1. 뇌 조직을 4 °C 또는 얼음 위에서 해동합니다.
  2. 조직을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 TRIzol 기반 방법13을 사용하여 전체 RNA를 추출합니다.
  3. RNA 추출 후 분광 광도계( 재료 표 참조)를 사용하여 RNA의 농도를 측정합니다.
  4. 상용 키트14를 사용하여 총 RNA(1μg)를 상보적 DNA(cDNA)로 역전사를 수행합니다.
  5. 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의한 유전자 발현 수준 측정15.

결과

생쥐의 수면 박탈에 대해 확립된 장치는 그림 1D에 나와 있습니다. 수면 박탈이 시작된 후 7일째에, 뇌전도(EEG) 및 근전도(EMG) 모니터링(EMG)은 장치가 생쥐의 수면 시간을 현저히 감소시키고 각성 시간을 증가시키는 것을 나타냈다(그림 2A-D). 한편, 현재 프로토콜은 뇌에서 Homer1a의 아데노신 축적 및 mRNA ?...

토론

수면 부족에 대한 마우스 모델은 심혈관 질환21, 정신 질환22 및 신경 장애23를 포함한 다양한 질병에 대한 수면 장애의 영향을 연구하는 데 필수적이다. 생쥐의 기존 수면 부족 전략 중 반복적인 단기간의 수면 중단을 포함하는 물리적 접근 방식이 가장 일반적으로 사용됩니다 5,7,12

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립자연과학재단(82230014, 81930007, 82270342), 상하이 우수 학술 지도자 프로그램(18XD1402400), 상하이시 과학기술위원회(22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), 상하이 푸장 인재 프로그램(2020PJD030), SHWSRS(2023-62), 상하이 노화 및 의학 임상 연구 센터(19MC1910500) 및 벵부 의과대학 대학원 혁신 프로그램의 보조금으로 지원되었습니다 (Byycxz21075)입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C-S
50 mL centrifuge tubeNEST602002
Adenosine ELISA kitRuifan technologyRF8885
Animal cageZeYa techMJ2
Blood glucose meterYuYue580
C57BL/6J MiceJieSiJie Laboratory AnimalN/AAge: 8-10 weeks
Connecting rodShengXiang TechN/ALength:  20 cm
Cooling fanLiMingEFB0805VHSupply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kitElabscienceE-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis systemPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluraneRWD20071302
mosquito hemostatsFST13011-12Surgical instrument
Motor and motor mountMingYangMY36GP-555Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Power brick adapterMingYangQiYe-0243Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kitVazymeQ711-02
qPCR measurement equipmentRoche480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinderCustomizedN/AWidth: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kitVazymeR323-01
Screw and nutGuwanjiN/AInner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinderCustomizedN/ALength: 300 mm
Slotted steel channelsCustomizedN/ALength: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactorLiXiangDH48S-SSupply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzolVazymeR401-01

참고문헌

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