Создание устройства для депривации сна у мышей

Резюме

В настоящем протоколе описывается метод создания экономически эффективного устройства на основе платформы Rocker, используемого для индуцирования депривации сна у мышей. Это устройство доказало свою эффективность в вызывании нарушений в режиме сна, подтвержденном электроэнцефалограммой (ЭЭГ), а также в индуцировании метаболических и молекулярных изменений, связанных с депривацией сна.

Аннотация

Нарушение циркадного ритма относится к рассинхронизации между внешней средой или поведением и эндогенными молекулярными часами, что значительно ухудшает здоровье. Недосыпание является одной из наиболее распространенных причин нарушения циркадного ритма. Сообщалось о различных способах (например, платформы на воде, мягкое обращение, скользящие стержневые камеры, вращающиеся барабаны, орбитальные шейкеры и т. д.) для индуцирования депривации сна у мышей, чтобы исследовать его влияние на здоровье. В настоящем исследовании представлен альтернативный метод депривации сна у мышей. Было разработано автоматизированное устройство на основе платформы коромысел, которое является экономичным и эффективно нарушает сон у мышей, содержащихся в группе, через регулируемые промежутки времени. Это устройство вызывает характерные изменения недосыпания с минимальной реакцией на стресс. Следовательно, этот метод может оказаться полезным для исследователей, заинтересованных в изучении влияния и лежащих в их основе механизмов депривации сна на патогенез многих заболеваний. Кроме того, это экономичное решение, особенно когда требуется параллельная работа нескольких устройств для лишения сна.

Введение

Нарушение циркадного ритма относится к рассинхронизации между внешней средой или поведением и эндогенными биологическими часами. Одной из наиболее распространенных причин нарушения циркадного ритма является недостаток^сна1. Недосыпание не только негативно сказывается на здоровье человека, но и значительно повышает риск многих заболеваний, в том числе^рака2 и сердечно-сосудистых^{заболеваний3}. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе пагубных последствий лишения сна, остаются в значительной степени неизвестными, и создание моделей депривации сна имеет важное значение для улучшения нашего понимания в этом отношении.

Сообщалось о различных методах депривации сна у мышей, таких как использование водных платформ⁴, бережное обращение⁵, скользящие стержневые камеры⁶, вращающиеся барабаны⁷ и протоколы перемешивания клеток ^5,8,9. Раздвижные стержневые камеры автоматически перемещают прутья по дну клетки, заставляя мышей ходить по ним и бодрствовать. Протоколы перемешивания в клетке включают размещение клеток на лабораторных орбитальных шейкерах, что приводит к эффективному нарушению сна. Несмотря на то, что эти методы являются автоматическими и эффективными, они могут быть дорогостоящими, когда требуется параллельная работа нескольких устройств, особенно для конкретных исследований, в которых участвует большое количество мышей, лишенных сна, необходимых для профилирования циркадных генов. С другой стороны, водные платформы и протоколы бережного обращения являются более дешевыми и простыми методами, обычно используемыми для того, чтобы вызвать лишение сна. Тем не менее, водная платформа не позволяет автоматически контролировать заранее заданные циклы депривации-отдыха^10,11, и бережное обращение требует от исследователей постоянной бдительности, чтобы нарушить сон. Кроме того, другие модальности, такие как вращающиеся барабаны, могут быть искажены социальной изоляцией^{или стрессом}.

Вдохновленные орбитальным встряхивающим методом, мы стремимся внедрить протокол для создания устройства на основе рокера для депривации сна у мышей. Этот метод дешевый, эффективный, минимально стрессовый, контролируемый и автоматизированный. Нынешний протокол позволяет создать устройство на базе рокеровой платформы по стоимости примерно в десять раз дешевле, чем у орбитальных шейкеров, исходя из нашей доступности. Это устройство эффективно нарушало сон у мышей, содержащихся в группах, и вызывало характерные изменения депривации сна с минимальной реакцией на стресс. Она будет особенно полезна исследователям, заинтересованным в изучении влияния и лежащих в ее основе механизмов депривации сна на патогенез множественных заболеваний, особенно когда исследование включает в себя параллельную депривацию сна в нескольких группах.

протокол

Все протоколы экспериментов на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по этике благополучия лабораторных животных больницы Жэньцзи, Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун. В исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Основные компоненты, необходимые для установки устройства, перечислены на рисунке 1A.

1. Подготовка устройства для депривации сна

1. Закрепите один конец стального швеллера с прорезями диаметром 50 см в середине стального швеллера с прорезями диаметром 40 см с помощью винтов (см. Таблицу материалов), чтобы получилась Т-образная конструкция; повторить процесс и сделать две такие Т-образные конструкции (рисунок 1Б-а).
2. Сделайте так, чтобы две Т-образные конструкции стояли параллельно вверх на расстоянии 30 см друг от друга, и соедините нижнюю часть двух Т-образных конструкций с помощью 30-сантиметрового стального цилиндра, совместимого с винтами (см. Таблицу материалов) с помощью винтов (Рисунок 1B-b).
3. Поместите стальную прямоугольную платформу (20 × 25 см) (см. Таблицу материалов) между двумя Т-образными конструкциями (Рисунок 1B-c).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если готовые стальные прямоугольные платформы указанного размера недоступны, их можно изготовить путем сварки плоских сталей толщиной 2 мм.
4. Закрепите каждый конец 30-сантиметрового совместимого с винтом стального цилиндра, прикрепленного к платформе, к двум подшипникам, закрепленным на каждой из Т-образных конструкций на расстоянии 10 см вниз от верха (рис. 1B-d).
5. Закрепите крепление двигателя (см. Таблицу материалов) на одной из Т-образных конструкций на расстоянии 25 см сверху с помощью винтов (рис. 1B-e).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать строительный клей для крепления опоры двигателя на Т-образной конструкции вместо экипажей.
6. Установите двигатель (см. Таблицу материалов) на опору двигателя с помощью винтов (Рисунок 1B-f).
7. Закрепите вентилятор охлаждения (см. Таблицу материалов) с помощью самоблокирующихся лент на Т-образной конструкции под двигателем (Рисунок 1B-g).
8. Прикрепите подшипниковый конец шатуна к углу платформы, обращенному к двигателю, с помощью винтов (Рисунок 1B-h).
9. Закрепите другой конец шатуна на валу двигателя с помощью винтов (рисунок 1B-i).
10. Просверлите два отверстия диаметром 4 мм в каждом из четырех углов пластикового контейнера или стандартной клетки для животных (см. Таблицу материалов) с помощью электрической дрели и просверлите два отверстия диаметром 4 мм и нижнее отверстие диаметром 6 мм с левой стороны клетки (Рисунок 1B-j).
11. Закрепите клетку на прямоугольной платформе самоблокирующимися лентами через угловые отверстия (рисунок 1B-k).
12. Просверлите отверстие диаметром 5 мм в крышке центрифужной пробирки объемом 50 мл с помощью электродрели и заткните отверстие длинной насадкой, оснащенной шаровым краном, чтобы предотвратить утечку воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель будет альтернативным вариантом для водоснабжения, если изготовление бутылок для воды по индивидуальному заказу затруднено.
13. Закрепите индивидуальную бутылку с водой с левой стороны клетки с помощью самоблокирующихся лент через два отверстия диаметром 4 мм, при этом сопло проходит через отверстие диаметром 6 мм (рис. 1B-l).
14. Подсоедините выходные электрические провода адаптера блока питания к двум клеммам двигателя (рисунок 1B-l).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подключения проводов к клеммам двигателя нет особых требований к полярности.
15. Подсоедините входные электрические провода адаптера блока питания к контактору времени (рис. 1B-m).

2. Индукция депривации сна

1. Нажимайте крайние правые кнопки со знаком «плюс» на левой и правой половинах контактора времени (см. Таблицу материалов) соответственно до тех пор, пока на механических счетчиках с обеих сторон не появится «М» (рис. 1C-a).
2. Нажимайте средние кнопки со знаком плюс на левой и правой половинах контактора времени до тех пор, пока на механических счетчиках с обеих сторон не появится «5M» (рис. 1C-b).
3. Нажимайте крайнюю левую кнопку со знаком «плюс» на левой половине контактора до тех пор, пока на левом механическом счетчике не появится «15M» (рис. 1C-c).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Затем контактор времени будет включен в течение 15 минут и выключен в течение 5 минут в циклическом режиме.
4. Помещайте мышей в клетку с водой и едой вволю.
5. Подайте питание на контактор времени и вентилятор охлаждения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь платформа будет раскачиваться со скоростью 10 оборотов в минуту.
6. Взвешивайте каждую мышь по времени Zeitgeber 0 (ZT0) каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свет горит с 8 утра (ZT0) до 8 вечера (ZT12).

3. Пероральный глюкозотолерантный тест

1. Измерьте уровень глюкозы натощак у голодных мышей, взяв кровь из хвостовых вен.
2. Ввести раствор глюкозы каждой мыши (2 г/кг массы тела) внутрибрюшинно с помощью шприцев по 1 мл.
3. Соберите образцы крови через хвостовую вену и проверьте уровень глюкозы в крови через 15 мин, 30 мин, 60 мин и 120 мин после инъекции глюкозы соответственно.
4. Поместите мышей обратно в клетку с едой и водой вволю после теста.

4. Забор мозговых тканей

1. Обезглавливайте мышей после адекватной анестезии, подвергая их воздействию изофлурана (2%) в течение 3-5 минут.
2. Обнажите череп и сделайте вертикальный надрез на черепе диаметром 1 см хирургическими ножницами.
3. Удалите череп с помощью комарных гемостатов (см. Таблицу материалов), чтобы обнажить мозговую ткань.
4. Аккуратно извлеките весь мозг из полости черепа с помощью изогнутого пинцета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мозговая ткань должна быть удалена в соответствии с местными правилами.
5. Промойте ткани мозга с помощью холодного фосфатного солевого раствора (1x PBS, 4 °C).
6. Snap заморозьте неповрежденную ткань мозга в жидком азоте и перенесите ткань до -80 °C для длительного хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при температуре -80°C замороженная ткань мозга стабильна в течение не менее 6 месяцев.

5. Определение экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

1. Разморозьте ткани мозга при 4 °C или на льду.
2. Перенесите ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и извлеките общую РНК с помощью метода¹³ на основе TRIzol.
3. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра (см. таблицу материалов) после экстракции РНК.
4. Выполните обратную транскрипцию общей РНК (1 мкг) в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью коммерческого набора¹⁴.
5. Измерение уровней экспрессии генов с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени¹⁵.

Результаты

Установленное устройство для депривации сна у мышей показано на рисунке 1D. На 7-й день после начала депривации сна электроэнцефалограмма (ЭЭГ) и электромиография (ЭМГ)¹⁶ показали, что устройство значительно сокращает продолжительность сна и увеличивает прод...

Обсуждение

Мышиные модели депривации сна необходимы для изучения влияния нарушения сна на различные заболевания, включая сердечно-сосудистые заболевания²¹, психические состояния²² и неврологические расстройства²³. Среди существующих стратегий лишения сна у...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
50 mL centrifuge tube	NEST	602002
Adenosine ELISA kit	Ruifan technology	RF8885
Animal cage	ZeYa tech	MJ2
Blood glucose meter	YuYue	580
C57BL/6J Mice	JieSiJie Laboratory Animal	N/A	Age: 8-10 weeks
Connecting rod	ShengXiang Tech	N/A	Length:  20 cm
Cooling fan	LiMing	EFB0805VH	Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kit	Elabscience	E-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis system	Pinnacle Technology	8200-K1-iSE3
Isoflurane	RWD	20071302
mosquito hemostats	FST	13011-12	Surgical instrument
Motor and motor mount	MingYang	MY36GP-555	Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c
Power brick adapter	MingYang	QiYe-0243	Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kit	Vazyme	Q711-02
qPCR measurement equipment	Roche	480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kit	Vazyme	R323-01
Screw and nut	Guwanji	N/A	Inner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Length: 300 mm
Slotted steel channels	Customized	N/A	Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactor	LiXiang	DH48S-S	Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzol	Vazyme	R401-01