Establecimiento de un dispositivo para la privación del sueño en ratones

Resumen

El presente protocolo describe un método para establecer un dispositivo rentable basado en una plataforma basculante utilizado para inducir la privación del sueño en ratones. Este dispositivo ha demostrado ser eficaz para causar interrupciones en los patrones de sueño evidenciados por electroencefalograma (EEG), así como para inducir cambios metabólicos y moleculares asociados con la privación del sueño.

Resumen

La alteración del ritmo circadiano se refiere a la desincronización entre el entorno o comportamiento externo y el reloj molecular endógeno, lo que perjudica significativamente la salud. La falta de sueño es una de las causas más comunes de alteración del ritmo circadiano. Se han reportado varias modalidades (por ejemplo, plataformas en el agua, manejo suave, cámaras de barras deslizantes, tambores giratorios, agitadores orbitales, etc.) para inducir la privación del sueño en ratones para investigar sus efectos sobre la salud. El estudio actual presenta un método alternativo para la privación del sueño en ratones. Se diseñó un dispositivo automatizado basado en una plataforma basculante que es rentable e interrumpe eficientemente el sueño en ratones alojados en grupo a intervalos de tiempo ajustables. Este dispositivo induce cambios característicos de privación del sueño con una respuesta mínima al estrés. En consecuencia, este método puede resultar útil para los investigadores interesados en estudiar los efectos y los mecanismos subyacentes de la privación del sueño en la patogénesis de múltiples enfermedades. Además, ofrece una solución rentable, especialmente cuando se requieren varios dispositivos de privación del sueño para funcionar en paralelo.

Introducción

La alteración del ritmo circadiano se refiere a la desincronización entre el entorno o comportamiento externo y el reloj biológico endógeno. Una de las causas más comunes de la alteración del ritmo circadiano es la falta de^sueño. La falta de sueño no solo afecta negativamente a la salud humana, sino que también aumenta significativamente el riesgo de muchas enfermedades, como el cáncer² y las enfermedades cardiovasculares³. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a los efectos perjudiciales de la privación del sueño siguen siendo en gran medida desconocidos, y el establecimiento de modelos de privación del sueño es esencial para mejorar nuestra comprensión al respecto.

Se han descrito varios métodos para la privación del sueño en ratones, como el uso de plataformas de agua⁴, manejo suave⁵, cámaras de barras deslizantes⁶, tambores giratorios⁷ y protocolos de agitación de jaulas ^5,8,9. Las cámaras de barras deslizantes barren automáticamente las barras a través del fondo de la jaula, lo que obliga a los ratones a caminar sobre ellas y permanecer despiertos. Los protocolos de agitación de jaulas implican la colocación de jaulas en agitadores orbitales de laboratorio, lo que resulta en una interrupción eficiente del sueño. Si bien estos métodos son automáticos y efectivos, pueden ser costosos cuando se requiere que varios dispositivos funcionen en paralelo, especialmente para diseños de estudios específicos que involucran una gran cantidad de ratones privados de sueño necesarios para el perfil genético circadiano. Por otro lado, las plataformas de agua y los protocolos de manejo suave son métodos más baratos y simples que se usan comúnmente para inducir la privación del sueño. Sin embargo, la plataforma de agua no permite el control automático de los ciclos de privación-descanso preespecificados^10,11, y el manejo suave requiere una vigilancia continua por parte de los investigadores para perturbar el sueño. Además, otras modalidades, como los tambores giratorios, pueden confundirse con el aislamiento social o el estrés¹².

Inspirados en el método basado en agitadores orbitales, nuestro objetivo es introducir un protocolo para establecer un dispositivo basado en una plataforma basculante para la privación del sueño en ratones. Este método es barato, efectivo, mínimamente estresante, controlable y automatizado. El protocolo actual nos permite crear un dispositivo basado en una plataforma basculante a un coste aproximadamente diez veces más barato que el de los agitadores orbitales, en función de nuestra accesibilidad. Este dispositivo interrumpió eficazmente el sueño en ratones alojados en grupos e indujo cambios característicos de privación del sueño con una respuesta mínima al estrés. Será especialmente útil para los investigadores interesados en investigar los efectos y los mecanismos subyacentes de la privación del sueño en la patogénesis de múltiples enfermedades, particularmente cuando el estudio involucra la privación del sueño en múltiples grupos en paralelo.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales con animales de este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar de Animales de Laboratorio del Hospital Renji, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái. En el estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J, con edades comprendidas entre las 8 y las 10 semanas. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las partes principales necesarias para establecer el dispositivo se enumeran en la Figura 1A.

1. Preparación del dispositivo de privación del sueño

1. Asegure un extremo de un canal de acero ranurado de 50 cm en el medio de un canal de acero ranurado de 40 cm con tornillos (consulte la Tabla de materiales) para hacer una estructura en forma de T; repita el proceso y haga dos estructuras en forma de T (Figura 1B-a).
2. Haga que las dos estructuras en forma de T se coloquen hacia arriba paralelamente a 30 cm de distancia y conecte la parte inferior de las dos estructuras en forma de T con un cilindro de acero compatible con tornillos de 30 cm (consulte la Tabla de materiales) con tornillos (Figura 1B-b).
3. Coloque una plataforma rectangular de acero (20 × 25 cm) (ver Tabla de Materiales) entre las dos estructuras en forma de T (Figura 1B-c).
   NOTA: Si no se dispone de plataformas rectangulares de acero listas para usar del tamaño especificado, se puede hacer una soldando aceros planos de 2 mm de espesor.
4. Asegure cada extremo de un cilindro de acero compatible con tornillos de 30 cm fijado en la plataforma a dos cojinetes fijados en cada una de las estructuras en forma de T a 10 cm por debajo de la parte superior (Figura 1B-d).
5. Asegure un soporte de motor (consulte la Tabla de materiales) en una de las estructuras en forma de T a 25 cm hacia abajo de la parte superior con tornillos (Figura 1B-e).
   NOTA: Alternativamente, se puede usar adhesivo de construcción para asegurar el soporte del motor en la estructura en forma de T en lugar de cuadrillas.
6. Instale un motor (consulte la Tabla de materiales) en el soporte del motor con tornillos (Figura 1B-f).
7. Asegure un ventilador de enfriamiento (consulte la Tabla de materiales) con bandas autoblocantes en la estructura en forma de T debajo del motor (Figura 1B-g).
8. Fije el extremo del cojinete de una biela a una esquina de la plataforma que mira hacia el motor con tornillos (Figura 1B-h).
9. Fije otro extremo de la biela al eje del motor con tornillos (Figura 1B-i).
10. Taladre dos agujeros de 4 mm en cada una de las cuatro esquinas de un recipiente de plástico o de una jaula estándar para animales (véase la Tabla de materiales) con un taladro eléctrico, y taladre dos agujeros de 4 mm y un agujero inferior de 6 mm en el lado izquierdo de la jaula (Figura 1B-j).
11. Asegure la jaula en la plataforma rectangular con bandas autoblocantes a través de los orificios de las esquinas (Figura 1B-k).
12. Taladre un orificio de 5 mm en la tapa de un tubo de centrífuga de 50 ml con un taladro eléctrico y enchufe el orificio con una boquilla larga equipada con una válvula de bola para evitar fugas de agua.
    NOTA: El hidrogel sería una opción alternativa para el suministro de agua si es difícil personalizar las botellas de agua.
13. Asegure la botella de agua personalizada en el lado izquierdo de la jaula con bandas autoblocantes a través de los dos orificios de 4 mm, con la boquilla pasando por el orificio de 6 mm (Figura 1B-l).
14. Conecte los cables eléctricos de salida del adaptador de bloque de alimentación a los dos terminales del motor (Figura 1B-l).
    NOTA: No hay ningún requisito de polaridad específico para conectar los cables a los terminales del motor.
15. Conecte los cables eléctricos de entrada del adaptador de bloque de alimentación al contactor de tiempo (Figura 1B-m).

2. Inducción de la privación del sueño

1. Presione los botones de signo más a la derecha en las mitades izquierda y derecha del contactor de tiempo (consulte la Tabla de materiales), respectivamente, hasta que aparezca "M" en los contadores mecánicos de ambos lados (Figura 1C-a).
2. Presione los botones centrales del signo más en las mitades izquierda y derecha del contactor de tiempo hasta que aparezca "5M" en los contadores mecánicos a ambos lados (Figura 1C-b).
3. Presione el botón del signo más a la izquierda en la mitad izquierda del contactor de tiempo hasta que aparezca "15M" en el contador mecánico izquierdo (Figura 1C-c).
   NOTA: El contactor de tiempo estará encendido durante 15 minutos y apagado durante 5 minutos en modo cíclico.
4. Pon a los ratones en la jaula con agua y comida ad libitum.
5. Suministre energía al contactor de tiempo y al ventilador de refrigeración.
   NOTA: La plataforma ahora se balanceará a 10 rpm.
6. Pesa cada ratón a la hora Zeitgeber 0 (ZT0) todos los días.
   NOTA: La luz está encendida desde las 8 a.m. (ZT0) hasta las 8 p.m. (ZT12).

3. Prueba de tolerancia oral a la glucosa

1. Mida los niveles de glucosa en ayunas en ratones en ayunas tomando muestras de sangre de las venas de la cola.
2. Inyectar solución de glucosa en cada ratón (2 g/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal utilizando jeringas de 1 ml.
3. Recoja muestras de sangre a través de la vena de la cola y mida la glucosa en sangre a los 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de la inyección de glucosa, respectivamente.
4. Vuelva a colocar a los ratones en la jaula con la comida y el agua ad libitum después de la prueba.

4. Recolección de los tejidos cerebrales

1. Decapitar a los ratones después de una anestesia adecuada exponiéndolos a isoflurano (2%) durante 3-5 minutos.
2. Exponga el cráneo y haga un corte vertical de 1 cm en el cráneo con unas tijeras quirúrgicas.
3. Extirpar el cráneo usando hemostáticos de mosquitos (ver Tabla de Materiales) para exponer el tejido cerebral.
4. Mueva suavemente todo el cerebro fuera de la cavidad craneal con pinzas curvas.
   NOTA: El tejido cerebral debe extirparse de acuerdo con las políticas locales.
5. Lavar el tejido cerebral con solución salina fría tamponada con fosfato (1x PBS, 4 °C).
6. Congele el tejido cerebral intacto en nitrógeno líquido y transfiera el tejido a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Cuando se almacena a -80 °C, el tejido cerebral ultracongelado es estable durante al menos 6 meses.

5. Detección de la expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

1. Descongelar los tejidos cerebrales a 4 °C o con hielo.
2. Transfiera el tejido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y extraiga el ARN total utilizando el método basado en TRIzol¹³.
3. Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales) después de la extracción de ARN.
4. Realizar la transcripción inversa del ARN total (1 μg) en ADN complementario (ADNc) utilizando un kit comercial¹⁴.
5. Medir los niveles de expresión génica mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real¹⁵.

Resultados

El dispositivo establecido para la privación del sueño en ratones se muestra en la Figura 1D. Al día 7 después del inicio de la privación del sueño, el electroencefalograma (EEG) y la electromiografía (EMG)¹⁶ indicaron que el dispositivo redujo significativamente la duración del sueño y aumentó la duración de la vigilia en ratones (Figura 2A-D). Mientras tanto, el protocolo actual aumentó sign...

Discusión

Los modelos murinos de privación del sueño son esenciales para estudiar los efectos de la interrupción del sueño en diversas enfermedades, incluidas las enfermedades cardiovasculares²¹, las afecciones psiquiátricas²² y los trastornos neurológicos²³. Entre las estrategias de privación de sueño existentes en ratones, los abordajes físicos que implican la interrupción repetitiva del sueño a corto plazo son los más utilizados

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
50 mL centrifuge tube	NEST	602002
Adenosine ELISA kit	Ruifan technology	RF8885
Animal cage	ZeYa tech	MJ2
Blood glucose meter	YuYue	580
C57BL/6J Mice	JieSiJie Laboratory Animal	N/A	Age: 8-10 weeks
Connecting rod	ShengXiang Tech	N/A	Length:  20 cm
Cooling fan	LiMing	EFB0805VH	Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticosterone ELISA kit	Elabscience	E-OSEL-M0001
EEG/EMG recording and analysis system	Pinnacle Technology	8200-K1-iSE3
Isoflurane	RWD	20071302
mosquito hemostats	FST	13011-12	Surgical instrument
Motor and motor mount	MingYang	MY36GP-555	Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c
Power brick adapter	MingYang	QiYe-0243	Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m
qPCR commercial kit	Vazyme	Q711-02
qPCR measurement equipment	Roche	480
Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm
Reverse RNA to cDNA commercial kit	Vazyme	R323-01
Screw and nut	Guwanji	N/A	Inner diameter: 6 mm, 12 mm
Screw-compatible steel cylinder	Customized	N/A	Length: 300 mm
Slotted steel channels	Customized	N/A	Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm
Time contactor	LiXiang	DH48S-S	Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT
TRIzol	Vazyme	R401-01