التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والتحليل المورفومتري لأدمغة حديثي الولادة في الفئران

Summary

تصف هذه الدراسة خطوات الحصول على صور عالية الدقة لأدمغة الفئران حديثي الولادة من خلال الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) وعامل التباين في عينات خارج الجسم الحي . نصف التحليلات المورفومترية الأساسية لتحديد حجم الدماغ وشكله في هذه الصور.

Abstract

الصور العصبية هي أداة قيمة لدراسة مورفولوجيا الدماغ في التجارب باستخدام النماذج الحيوانية. أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الطريقة القياسية للأنسجة الرخوة ، على الرغم من أن دقته المكانية المنخفضة تفرض بعض القيود على الصغيرة. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (3D) عن أدمغة وجماجم حديثي الولادة في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT). يتضمن البروتوكول تلك الخطوات اللازمة لتشريح العينات ، وصبغ الدماغ ومسحه ضوئيا ، والحصول على قياسات مورفومترية للعضو بأكمله والمناطق ذات الاهتمام (ROIs). يتضمن تحليل الصور تجزئة الهياكل ورقمنة إحداثيات النقاط. باختصار ، يوضح هذا العمل أن الجمع بين التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ومحلول Lugol كعامل تباين هو بديل مناسب لتصوير أدمغة الصغيرة في الفترة المحيطة بالولادة. يحتوي سير عمل التصوير هذا على تطبيقات في علم الأحياء التنموي والطب الحيوي والعلوم الأخرى المهتمة بتقييم تأثير العوامل الوراثية والبيئية المتنوعة على نمو الدماغ.

Introduction

يعد التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) أداة قيمة لمختلف مجالات البحث. في علم الأحياء ، وهي مناسبة بشكل خاص لأبحاث العظام بسبب امتصاص الأشعة السينية في الأنسجة المعدنية. بسبب هذه الميزة ، تم تناول أسئلة متنوعة تتعلق بتطور العظام¹ ، والتمثيل الغذائي² ، والتطور^3،4 ، من بين مواضيع أخرى ، بمساعدة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. في عام 2008 ، أظهر de Crespigny et ^al.5 أنه يمكن الحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة لأدمغة الفئران والأرانب البالغة باستخدام اليود كعامل تباين. فتح هذا العمل تطبيقا جديدا لتقنية ا....

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات التجريبية إرشادات المجلس الكندي لرعاية.

1. جمع العينات وإعدادها

1. تحضير 500 مل من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA).
   1. تحت تدفق الاستخراج في خزانة ، أضف 20 جم من مسحوق PFA إلى 250 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في دورق زجاجي سعة 1 لتر. ضع الدورق بمغناطيس على لوح تحريك مغناطيسي.
   2. يقلب أثناء التسخين. باستخدام مقياس حرارة ، تحقق باستمرار من درجة حرارة المحلول لإبقائه أقل من 60 درجة مئوية.
   3. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، أضف قطرات من 1 M NaOH إلى المحلول لإذابة PFA. بمجرد أن يذوب مسحوق PFA تماما ، قم بتبريد المحلول في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. اضبط مستوى الصوت ....

النتائج

هنا ، يتم تقديم بروتوكول أساسي للحصول على صور عالية الدقة لأدمغة الفئران حديثي الولادة. تم مسح الرؤوس بعد الغمر في محلول Lugol. على الرغم من صغر حجمها ، يمكن تمييز الهياكل التشريحية الرئيسية للدماغ ، مثل المصابيح الشمية والقشرة والدماغ المتوسط والمخيخ والدماغ الخلفي (الشكل 1).......

Discussion

في هذا العمل ، تم تقديم بروتوكول موجز لمسح أنسجة دماغ الأطفال حديثي الولادة للفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع عامل تباين. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن إجراءات بسيطة للحصول على مخرجات كمية ونوعية. واستنادا إلى هذه الأساليب، يمكن إجراء المزيد من التحليلات البديلة أو التكميلية.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650