Imágenes de micro-TC y análisis morfométrico de cerebros neonatales de ratones

Resumen

Este estudio describe los pasos para obtener imágenes de alta resolución de cerebros de ratones neonatos mediante la combinación de microtomografía computarizada (micro-CT) y un agente de contraste en muestras ex vivo . Describimos análisis morfométricos básicos para cuantificar el tamaño y la forma del cerebro en estas imágenes.

Resumen

Las neuroimágenes son una herramienta valiosa para estudiar la morfología cerebral en experimentos con modelos animales. La resonancia magnética (RM) se ha convertido en el método estándar para los tejidos blandos, aunque su baja resolución espacial plantea algunos límites para los animales pequeños. Aquí, describimos un protocolo para obtener información tridimensional (3D) de alta resolución en cerebros y cráneos de ratones recién nacidos mediante microtomografía computarizada (micro-CT). El protocolo incluye los pasos necesarios para diseccionar las muestras, teñir y escanear el cerebro, y obtener mediciones morfométricas de todo el órgano y las regiones de interés (ROI). El análisis de imágenes incluye la segmentación de estructuras y la digitalización de coordenadas puntuales. En resumen, este trabajo muestra que la combinación de micro-CT y la solución de Lugol como agente de contraste es una alternativa adecuada para obtener imágenes del cerebro perinatal de pequeños animales. Este flujo de trabajo de imágenes tiene aplicaciones en biología del desarrollo, biomedicina y otras ciencias interesadas en evaluar el efecto de diversos factores genéticos y ambientales en el desarrollo del cerebro.

Introducción

La microtomografía computarizada (micro-TC) es una herramienta valiosa para diferentes campos de investigación. En biología, es especialmente adecuado para la investigación ósea debido a la absorción de rayos X en los tejidos mineralizados. Debido a esta característica, se han abordado diversas cuestiones relacionadas con el desarrollo óseo¹, el metabolismo² y la evolución ^3,4, entre otros temas, con la ayuda de micro-CT. En 2008, de Crespigny et ^al.5 demostraron que se podían obtener imágenes de micro-TC de cerebros ....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales siguieron las directrices del Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales.

1. Recogida y preparación de muestras

1. Prepare 500 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%.
   1. Bajo un fundente de extracción en un armario, añadir 20 g de PFA en polvo a 250 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x en un vaso de precipitados de vidrio de 1 L. Coloque el vaso de precipitados con un imán en una placa de agitación magnética.
   2. Revuelva mientras calienta. Con un termómetro, verifique constantemente la temperatura de la solución para mantenerla por debajo de 60 °....

Resultados

Aquí, se presenta un protocolo básico para obtener imágenes de alta resolución de cerebros de ratones neonatos. Las cabezas fueron escaneadas después de la inmersión en la solución de Lugol. A pesar de su pequeño tamaño, se pueden distinguir las principales estructuras anatómicas cerebrales, como los bulbos olfatorios, la corteza, el mesencéfalo, el cerebelo y el cerebro posterior (Figura 1).

Se pueden realizar diferentes análisis utilizando estas imá.......

Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo conciso para escanear tejidos cerebrales neonatales de ratones mediante micro-TC con un agente de contraste. Además, incluye procedimientos sencillos para obtener resultados cuantitativos y cualitativos. Sobre la base de estos métodos, se pueden realizar otros análisis alternativos o complementarios.

Como se muestra en el protocolo, las imágenes de micro-TC se pueden analizar de diferentes maneras. En estudios previos, nuestro grupo estimó la varia.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650