Imágenes de micro-TC y análisis morfométrico de cerebros neonatales de ratones

Resumen

Este estudio describe los pasos para obtener imágenes de alta resolución de cerebros de ratones neonatos mediante la combinación de microtomografía computarizada (micro-CT) y un agente de contraste en muestras ex vivo . Describimos análisis morfométricos básicos para cuantificar el tamaño y la forma del cerebro en estas imágenes.

Resumen

Las neuroimágenes son una herramienta valiosa para estudiar la morfología cerebral en experimentos con modelos animales. La resonancia magnética (RM) se ha convertido en el método estándar para los tejidos blandos, aunque su baja resolución espacial plantea algunos límites para los animales pequeños. Aquí, describimos un protocolo para obtener información tridimensional (3D) de alta resolución en cerebros y cráneos de ratones recién nacidos mediante microtomografía computarizada (micro-CT). El protocolo incluye los pasos necesarios para diseccionar las muestras, teñir y escanear el cerebro, y obtener mediciones morfométricas de todo el órgano y las regiones de interés (ROI). El análisis de imágenes incluye la segmentación de estructuras y la digitalización de coordenadas puntuales. En resumen, este trabajo muestra que la combinación de micro-CT y la solución de Lugol como agente de contraste es una alternativa adecuada para obtener imágenes del cerebro perinatal de pequeños animales. Este flujo de trabajo de imágenes tiene aplicaciones en biología del desarrollo, biomedicina y otras ciencias interesadas en evaluar el efecto de diversos factores genéticos y ambientales en el desarrollo del cerebro.

Introducción

La microtomografía computarizada (micro-TC) es una herramienta valiosa para diferentes campos de investigación. En biología, es especialmente adecuado para la investigación ósea debido a la absorción de rayos X en los tejidos mineralizados. Debido a esta característica, se han abordado diversas cuestiones relacionadas con el desarrollo óseo¹, el metabolismo² y la evolución ^3,4, entre otros temas, con la ayuda de micro-CT. En 2008, de Crespigny et ^al.5 demostraron que se podían obtener imágenes de micro-TC de cerebros adultos de ratón y conejo utilizando yodo como agente de contraste. Este trabajo abrió una nueva aplicación para esta técnica de imagen, ya que el yodo permitió la adquisición de imágenes de tejidos blandos que de otro modo serían insensibles a los rayos X. Por lo tanto, el objetivo general de combinar la micro-TC y un agente de contraste a base de yodo es obtener imágenes de alta resolución, en las que los tejidos blandos puedan distinguirse e identificarse a nivel anatómico meso o macro.

Esta técnica tiene un potencial notable para estudios que requieren una caracterización fenotípica detallada ex vivo de especímenes pequeños, como embriones de ratón, que son ampliamente utilizados en diseños experimentales⁶. El contraste de yodo en combinación con imágenes de micro-TC se ha utilizado para obtener cuantificaciones volumétricas de órganos⁷ y estructuras tridimensionales (3D) de puntos de referencia ^8,9. En los últimos años, se ha aplicado la microtomografía computarizada de muestras teñidas para describir las características fenotípicas cerebrales de roedores¹⁰, y se han propuesto diferentes mejoras a la técnica. Para cerebros adultos, se encontró que un protocolo de 48 h de inmersión en yodo, con un paso previo de perfusión con un hidrogel, produjo imágenes de alta calidad¹¹. Gignac et ^al.12 ampliaron los límites de esta técnica al demostrar que cerebros de rata teñidos con yodo podían ser procesados para realizar técnicas histológicas rutinarias. Del mismo modo, estos procedimientos demuestran resultados prometedores para cerebros de roedores embrionarios y pre-destete 8,13,14,15.

Aunque la neurociencia ha aplicado en gran medida técnicas basadas en microscopios para evaluar diferentes aspectos estructurales y funcionales del desarrollo cerebral, estos estudios son más adecuados para caracterizar poblaciones celulares específicas o estructuras espacialmente limitadas. Por el contrario, la imagen de micro-TC permite la descripción de estructuras completas y la adquisición de modelos 3D que conservan información espacial relevante, que es complementaria a las técnicas microscópicas. La resonancia magnética (RM) también es una técnica estándar aplicada para explorar las características estructurales de los pequeños animales 16,17,18. Sin embargo, la micro-TC, con el uso de un agente de contraste, tiene dos ventajas principales para las muestras fijas ex vivo: los escáneres de micro-TC son en gran medida menos costosos y fáciles de operar, y permiten una resolución espacial más alta que la RM¹².

El objetivo de este trabajo es describir el procedimiento para obtener imágenes de alta resolución de cerebros de ratones neonatos mediante microtomografía computarizada después de la tinción con la solución de Lugol, un agente de contraste a base de yodo. Se presenta un protocolo integral, que comienza con etapas preliminares, como la recolección de muestras y la fijación de tejidos, y pasa por la tinción, la adquisición de imágenes por micro-TC y el procesamiento estándar. El procesamiento de imágenes incluye la segmentación de un volumen 3D de la cabeza completa, así como del cerebro, y la selección de planos anatómicos específicos para digitalizar coordenadas puntuales que luego podrían utilizarse en análisis morfométricos. Aunque el enfoque aquí es el cerebro de ratón neonatal, se pueden aplicar estrategias similares a otros tejidos blandos. Por lo tanto, el protocolo presentado aquí es lo suficientemente flexible como para ser aplicado, con modificaciones sutiles, a otros tipos de muestras.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales siguieron las directrices del Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales.

1. Recogida y preparación de muestras

1. Prepare 500 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%.
   1. Bajo un fundente de extracción en un armario, añadir 20 g de PFA en polvo a 250 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x en un vaso de precipitados de vidrio de 1 L. Coloque el vaso de precipitados con un imán en una placa de agitación magnética.
   2. Revuelva mientras calienta. Con un termómetro, verifique constantemente la temperatura de la solución para mantenerla por debajo de 60 ° C.
   3. Con una pipeta Pasteur de plástico, agregue gotas de 1 M de NaOH a la solución para disolver el PFA. Una vez que el polvo de PFA se haya disuelto por completo, enfríe la solución a temperatura ambiente (RT).
   4. Ajuste el volumen a 500 ml con 1x PBS. Ajuste el pH a 7,2-7,3 añadiendo gotas de HCl 1 M con una pipeta Pasteur de plástico.
   5. Con un filtro de papel y un embudo de vidrio, filtre la solución en una botella de vidrio de 1 L.
   6. Cierre el frasco de vidrio, sáquelo del gabinete de fundente y guárdelo en el refrigerador a -4 °C.
2. Recolecta muestras de cerebro.
   1. Para obtener muestras, se sacrificaron neonatos de ratón a la mañana siguiente de su nacimiento, a los 0,5 días de edad (P 0,5), utilizando tijeras quirúrgicas para decapitarlos.
   2. Coloque las tijeras en el cuello del neonato mientras sostiene el cuerpo, y realice un corte único y limpio.
3. Fije las muestras en PFA.
   1. Llene un tubo cónico de 50 ml con 40 ml de PFA al 4%.
   2. Sumerja cada cabezal en el tubo que contiene PFA como agente de fijación. Para esta acción, use una espátula Paton o una cuchara.
   3. Almacenar los tubos cónicos en el frigorífico a -4 °C durante 48 h, luego cambiar a 40 mL de 1x PBS con azida sódica al 0,1% como conservante. Mantener refrigerado a -4 °C.

2. Tinción de muestras

1. Preparar la solución de Lugol (3,75% p/v).
   1. Bajo un fundente de extracción en una cabina, en un vaso de precipitados de vidrio de 1 L, disolver 10 g de Kl y 5 g de_I2 en 400 mL de agua destilada, con una mezcla constante utilizando un agitador magnético.
2. Sumerja cada cabezal en un tubo cónico de 50 ml que contenga 40 ml de solución de Lugol.
   1. Para neonatos de un tamaño corporal aproximado de 1,3 g, dejar las muestras sumergidas durante 15-20 h con una mezcla constante utilizando un agitador orbital.
   2. Colocar las muestras en un tubo cónico de 15 mL que contenga 10 mL de agarosa al 1% durante 30 min antes de escanear.

3. Micro-CT

NOTA: La exploración por microtomografía computarizada requiere un equipo específico. Existen diferentes opciones para este tipo de escáner, y los detalles de la adquisición dependen de las características del equipo utilizado. El laboratorio del Dr. Hallgrímsson cuenta con algunas alternativas a los escáneres de micro-CT. En este caso, el protocolo se basa en el uso de un escáner de escritorio básico, que se encuentra entre las máquinas de imágenes de animales pequeños más accesibles utilizadas por los laboratorios de todo el mundo. Si el objetivo de escaneo es el cráneo, omita los pasos de la sección 2 del protocolo y continúe con la sección 3. Después de escanear el cráneo, se podría realizar el proceso de tinción y el escaneo del cerebro para obtener imágenes de los mismos especímenes tanto del cerebro como del cráneo.

1. Coloque la muestra en el soporte de micro-CT.
   1. Coloque la muestra en un tubo cónico de 50 ml. Fije la muestra para evitar movimientos durante la sesión de escáner. Para ello, se puede utilizar algún material de poliuretano para rellenar las partes vacías del tubo.
   2. Abra el equipo y coloque el tubo con la muestra en el soporte de micro-CT.
   3. Inicie sesión en el panel de control de micro-CT y registre la muestra que se va a escanear. Esto generará automáticamente un número de muestra. Además del número, rellene el campo "Nombre". Tanto el nombre como el número de la muestra deben registrarse en otro lugar (por ejemplo, en una hoja de cálculo) en caso de que sea necesario recuperar los datos sin procesar nuevamente.
   4. Inicie el programa de escaneo. Introduzca el nombre o el número de la muestra y seleccione un archivo de control , que debe contener los parámetros de escaneo.
2. Escanee la muestra.
   1. En la pantalla del software micro-CT, establezca los siguientes parámetros: tamaño de vóxel isotrópico de 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, tiempo de integración de 800.000 ms y 500 proyecciones por 180°.
   2. Establezca la región de escaneo seleccionando Vista de explorador. Una vez que aparezca la imagen de referencia, pulse Línea de referencia para definir la región. Mueva la línea verde continua hasta el borde de la muestra y, a continuación, mantenga pulsada la tecla Mayús mientras arrastra el cursor para extender la región de escaneo hasta el otro borde de la muestra.
   3. Seleccione Aceptar para comenzar el análisis.
3. Evalúe y exporte el escaneo.
   1. Abra el programa de evaluación del escáner de micro-CT y haga clic en Seleccionar muestra y medición. En el campo Filtro , escriba el nombre de la muestra, seleccione la muestra y seleccione el archivo de medición.
   2. El archivo se cargará como segmentos, cuyo número depende de la ventana de escaneo inicial. Haga clic en el botón Cargar todo , que cargará cada rebanada y facilitará el movimiento entre rebanadas más adelante.
   3. Seleccione Tareas > Evaluación 3D para inicializar un cuadro de recorte alrededor de los sectores. Aparecerá un mensaje de evaluación 3D con una serie de campos, incluidos Tarea/Evaluación, VOI (Volumen de interés), Inicio X, Y, Z y Dimensión X, Y, Z.
   4. Establezca el campo Tarea > evaluación 3D en el script adecuado, ya que se pueden realizar diversas tareas de evaluación, como la reconstrucción, la segmentación, la morfometría (por ejemplo, la densidad mineral ósea) y las conversiones o transferencias de archivos. El script de evaluación predeterminada se puede utilizar como guía.
   5. Después de seleccionar el script, ajuste el cuadro VOI en la imagen principal. Comience con la primera rebanada. Asegúrese de que la caja contenga la anatomía que se va a evaluar. Mueva el VOI haciendo clic con el botón derecho en uno de los pequeños cuadrados blancos hacia el borde del cuadro y cambiando el tamaño del VOI con el botón central del mouse. También puede ajustar numéricamente los campos de dimensión .
   6. Pase a través de la muestra usando la barra de desplazamiento debajo de la imagen para asegurarse de que todas las anatomías se hayan capturado en el cuadro VOI. Haga clic en XY, XZ o YZ cerca de la parte superior izquierda del software para cambiar la orientación.
   7. Seleccione Iniciar evaluación. Dependiendo del script de evaluación de tareas, se generará un archivo de imagen .aim 3D con un archivo de encabezado .txt correspondiente. Además, se puede especificar una ruta en el script para el protocolo de transferencia de archivos (FTP) de la imagen a una ubicación determinada.

4. Procesamiento de imágenes

1. Abra las imágenes en el software de procesamiento de imágenes.
   NOTA: El procesamiento de imágenes se puede llevar a cabo utilizando varios programas informáticos. Este protocolo incluye los pasos básicos en un software comercial, el cual es ampliamente aceptado en el área y cuenta con herramientas versátiles para el procesamiento básico y avanzado. Además, existen diferentes formatos aceptables para las imágenes de micro-TC reconstruidas. Este aspecto suele depender del equipo utilizado para la adquisición y de su software. Aquí, el procesamiento de imágenes se lleva a cabo con .bmp imágenes. El mismo procedimiento se puede aplicar para .tiff imágenes y otros tipos. Dado que la adquisición se lleva a cabo en un escáner con .aim como formato predeterminado, primero se presenta una conversión de .aim a .bmp.
   1. Para abrir archivos .aim, seleccione Archivo > Datos abiertos y elija el archivo. Después de eso, se abrirá una ventana con el título Selección de formato de archivo. Seleccione Datos sin procesar.
   2. Se abrirá una ventana con el título Parámetros de datos sin procesar. En esta ventana, rellene los parámetros siguiendo la información del archivo de encabezado .txt que se genera para cada archivo .aim. En Tipo de datos, elija 16 bits para encabezado completo con el número después de que los datos de imagen comiencen en el desplazamiento de bytes. Además, establezca las dimensiones y el tamaño del vóxel utilizando la información del archivo de encabezado .txt. Una vez que los parámetros estén completos, presione OK.
   3. Si es necesaria la conversión de .aim a .bmp, en el panel principal > la vista de proyecto, haga clic con el botón derecho en el objeto .aim y seleccione la opción Convertir > Convertir tipo de imagen. En Propiedades, seleccione 8 bits como Tipo de salida. Seleccione Aplicar.
   4. Haga clic con el botón derecho en el nuevo objeto de 8 bits. Seleccione Guardar como. Elija .bmp y guarde.
   5. Para abrir el archivo .bmp, seleccione Archivo > Datos abiertos y elija el archivo. Después de eso, se abre una ventana con los parámetros de la imagen. Confirme los parámetros y acéptelos si son correctos.
   6. En el panel principal > la vista de proyecto, se crea un nuevo objeto con el nombre de los archivos .bmp. Haga clic con el botón derecho en este objeto y seleccione la opción Ortho Slice. En Propiedades, seleccione el número de sector y el plano de orientación que desea ver.
2. Obtener volúmenes 3D de la cabeza completa.
   1. En el panel principal > la vista de proyecto, haga clic con el botón derecho en el objeto de imagen. Seleccione la opción Umbral interactivo > Crear. En Propiedades, cambie los valores de RGB mínimo y RGB máximo hasta que se seleccione la parte de la imagen correspondiente a la cabeza del animal. Seleccione Aplicar.
   2. En el panel principal > la vista de proyecto, se crea un objeto con umbral. Haga clic con el botón derecho en este objeto y, en Propiedades, seleccione Isosuperficie. En Propiedades, elija un umbral para visualizar la superficie y haga clic en Aplicar. Este umbral debe elegirse empíricamente, luego es posible que sea necesario examinar diferentes valores.
3. Digitalización de coordenadas de puntos
   1. Las coordenadas de puntos 3D se pueden digitalizar tanto en función de cortes como de superficies extraídas. Para la primera opción, haga clic con el botón derecho en la opción de imagen y seleccione Cortar. En Traslación, elija el sector deseado en el plano axial. Si el plano no está colocado correctamente, haga clic en Opciones > Rotar en Propiedades para establecer la orientación correcta.
   2. Para digitalizar puntos de referencia, haga clic con el botón derecho en el panel principal > Vista de proyecto y seleccione Crear objeto > puntos y líneas > puntos de referencia. Haga clic con el botón derecho en los nuevos puntos de referencia de objetos y seleccione Vista de puntos de referencia. En Vista de hito, modifique el tamaño del punto en Tamaño. Para agregar puntos de referencia en Propiedades, use la opción Agregar en modo de edición.
      NOTA: En el caso de los recién nacidos, se publicó previamente un conjunto de puntos de referencia y semipuntos de referencia alrededor de las curvas axial y sagital del cerebro¹⁴.
   3. En primer lugar, elige el plano axial que cruza el punto más rostral de los bulbos olfatorios y el punto más caudal de la corteza.
   4. Seleccione los puntos de referencia del objeto y, en Propiedades, seleccione Editor de puntos de referencia. Con la flecha, haga clic en el lugar donde se va a digitalizar el punto.
   5. En el conjunto de puntos de referencia propuesto, se digitalizan 24 puntos en el plano axial seleccionado. Digitaliza el primero en el punto más caudal del cerebro en la línea media.
   6. Digitaliza cinco puntos distribuidos equitativamente alrededor de la curva (semipuntos de referencia) hasta el siguiente punto de referencia en la intersección entre el mesencéfalo y la corteza.
   7. A continuación, digitaliza ocho puntos (semipuntos de referencia) alrededor de la corteza.
   8. Digitalice un nuevo punto de referencia en la intersección entre la corteza y los bulbos olfatorios. A continuación, digitaliza cuatro puntos (semirlandos) alrededor de los bulbos olfatorios.
   9. Digitalizar un nuevo punto de referencia en el punto más rostral de los bulbos olfatorios en la línea media. A continuación, digitaliza dos puntos (semirreferencias) entre ambos bulbos olfatorios.
   10. Digitaliza un nuevo punto de referencia en el punto más caudal de los bulbos olfatorios en la línea media.
   11. Para los puntos sagitales, establezca un corte en el lado derecho del cerebro en un plano parasagital donde el cerebro es más caudalmente prominente.
   12. En el conjunto de puntos de referencia propuestos, se digitalizan 33 puntos en el plano parasagital seleccionado. Digitaliza el primero en la intersección entre el diencéfalo y el cerebro posterior. A continuación, digitaliza nueve puntos (semirlandos) en el límite ventral del cerebro.
   13. Digitaliza un nuevo punto de referencia en el punto más rostral del bulbo olfatorio. A continuación, digitaliza tres puntos (puntos de referencia) alrededor de los bulbos olfatorios.
   14. Digitaliza un nuevo punto de referencia en la intersección entre el bulbo olfatorio y la corteza. A continuación, digitaliza tres puntos (puntos de referencia) alrededor de los bulbos olfatorios.
   15. Digitaliza un nuevo punto de referencia en la intersección entre el bulbo olfatorio y la corteza. A continuación, digitaliza siete puntos (puntos de referencia) alrededor de la corteza.
   16. Digitaliza un nuevo punto de referencia en la intersección entre la corteza y el mesencéfalo. A continuación, digitaliza siete puntos (puntos de referencia) alrededor de la corteza.
   17. Digitaliza un nuevo punto de referencia en la intersección entre la corteza y el mesencéfalo. A continuación, digitaliza seis puntos (puntos de referencia) alrededor del mesencéfalo.
   18. Digitaliza un nuevo punto de referencia en la intersección entre el mesencéfalo y el cerebelo. Luego, digitaliza dos puntos (semirreferencias) alrededor del cerebelo.
   19. Digitaliza un nuevo punto de referencia en la intersección entre el cerebelo y el cerebro posterior.
   20. Guarde los puntos digitalizados. Haga clic con el botón derecho en los puntos de referencia del objeto y elija la opción Guardar datos.
4. Analice las coordenadas de los puntos.
   NOTA: Una vez digitalizadas las coordenadas puntuales de un conjunto de probetas, se pueden realizar análisis básicos utilizando herramientas de morfometría geométrica para obtener variables de tamaño (tamaño del centroide) y forma (coordenadas de forma o de Procusto). Los análisis se llevan a cabo en un entorno de software libre y abierto, que es especialmente adecuado para análisis estadísticos.
   1. Usando un bloc de notas, construya un archivo que contenga las coordenadas de todos los especímenes digitalizados. Para ello, siga el formato TPS, tal y como se describe en https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
   2. Abra el software estadístico. Seleccione Archivo > Cambiar directorio para elegir el directorio donde se guarda el archivo .tps.
   3. Seleccione Paquetes > Instalar paquetes. Elige un espejo de Cran. Busca geomorph e instálalo.
   4. Cargue paquetes escribiendo en la consola: library(geomorph) y library(Morpho).
   5. Cargue el conjunto de datos escribiendo en la consola: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
   6. Realice un análisis generalizado de Procusto escribiendo en la consola: GPA<- gpagen(dataset).
   7. Obtenga el tamaño del centroide escribiendo en la consola: CS<-GPA$Csize.
   8. Obtenga las coordenadas de Procusto escribiendo en la consola: ProcCoord<- GPA$coords.
   9. Trace las coordenadas de Procusto y la forma media escribiendo en la consola: plotAllSpecimens(ProcCoord).
5. Segmentación de los ROI
   NOTA: Para segmentar el cerebro y obtener una reconstrucción en 3D, identifique manualmente los tejidos cerebrales en cada corte. El mismo procedimiento se puede aplicar a ROI específicos, como los bulbos olfatorios, la corteza, etc.
   1. Haga clic con el botón derecho en el panel principal > Vista de proyecto y seleccione Crear objeto > campo de etiqueta.
   2. Al seleccionar el objeto Campo de etiqueta , presione la opción Editor de segmentación en Propiedades.
   3. En Materiales, agregue un nuevo material y, si lo desea, cámbiele el nombre a Cerebro.
   4. En Selección, elija la opción Current Slice para segmentar el tejido correspondiente al cerebro en cada corte.
   5. Con las opciones presentes en Herramientas, seleccione el tejido cerebral en cada corte. Para este caso, la Varita Mágica y el Pincel son los más adecuados.
   6. Una vez realizada la selección en cada sector, pulse Añadir en selección.
   7. Cuando finalice la selección de todos los sectores, vuelva a la vista de proyecto en el panel principal y haga clic con el botón derecho en Campo de etiqueta para seleccionar Generar superficie y, a continuación, haga clic en Aplicar.
   8. Una vez obtenida la superficie, expórtala aplicando Extraer superficie.
   9. Para obtener el volumen de las estructuras segmentadas, en el panel principal > la vista de proyecto, seleccione el objeto que contiene la etiqueta, haga clic con el botón derecho y seleccione Medir y analizar > fracción de volumen. A continuación, haga clic en Aplicar.

Resultados

Aquí, se presenta un protocolo básico para obtener imágenes de alta resolución de cerebros de ratones neonatos. Las cabezas fueron escaneadas después de la inmersión en la solución de Lugol. A pesar de su pequeño tamaño, se pueden distinguir las principales estructuras anatómicas cerebrales, como los bulbos olfatorios, la corteza, el mesencéfalo, el cerebelo y el cerebro posterior (Figura 1).

Se pueden realizar diferentes análisis utilizando estas imá...

Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo conciso para escanear tejidos cerebrales neonatales de ratones mediante micro-TC con un agente de contraste. Además, incluye procedimientos sencillos para obtener resultados cuantitativos y cualitativos. Sobre la base de estos métodos, se pueden realizar otros análisis alternativos o complementarios.

Como se muestra en el protocolo, las imágenes de micro-TC se pueden analizar de diferentes maneras. En estudios previos, nuestro grupo estimó la varia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650