Imagerie micro-tomodensitométrie et analyse morphométrique du cerveau néonatal de souris

Résumé

Cette étude décrit les étapes permettant d’obtenir des images à haute résolution du cerveau de souris néonatales en combinant la micro-tomodensitométrie (micro-TDM) et un agent de contraste dans des échantillons ex vivo . Nous décrivons des analyses morphométriques de base pour quantifier la taille et la forme du cerveau dans ces images.

Résumé

Les neuroimages sont un outil précieux pour étudier la morphologie du cerveau dans des expériences utilisant des modèles animaux. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est devenue la méthode standard pour les tissus mous, bien que sa faible résolution spatiale pose certaines limites pour les petits animaux. Nous décrivons ici un protocole permettant d’obtenir des informations tridimensionnelles (3D) à haute résolution sur le cerveau et le crâne de nouveau-nés de souris à l’aide de la micro-tomodensitométrie (micro-TDM). Le protocole comprend les étapes nécessaires pour disséquer les échantillons, colorer et scanner le cerveau, et obtenir des mesures morphométriques de l’organe entier et des régions d’intérêt (ROI). L’analyse d’images comprend la segmentation des structures et la numérisation des coordonnées des points. En résumé, ce travail montre que la combinaison de la micro-tomodensitométrie et de la solution de Lugol comme agent de contraste est une alternative appropriée pour l’imagerie du cerveau périnatal des petits animaux. Ce flux de travail d’imagerie a des applications en biologie du développement, en biomédecine et dans d’autres sciences intéressées par l’évaluation de l’effet de divers facteurs génétiques et environnementaux sur le développement du cerveau.

Introduction

L’imagerie par micro-tomodensitométrie (micro-TDM) est un outil précieux pour différents domaines de recherche. En biologie, il est particulièrement adapté à la recherche osseuse en raison de l’absorption des rayons X dans les tissus minéralisés. En raison de cette caractéristique, diverses questions concernant le développement osseux¹, le métabolisme² et l’évolution ^3,4, entre autres sujets, ont été abordées à l’aide de micro-CT. En 2008, de Crespigny et ^al.5 ont montré que des images micro-CT de cerveaux de souris et de lapins adultes pouvaient être obtenues en utilisant de l’iode comme agent de contraste. Ce travail a ouvert une nouvelle application pour cette technique d’imagerie, car l’iode a permis d’acquérir des images à partir de tissus mous qui seraient autrement insensibles aux rayons X. Ainsi, l’objectif général de la combinaison de la micro-tomodensitométrie et d’un agent de contraste à base d’iode est d’obtenir des images à haute résolution, dans lesquelles les tissus mous peuvent être distingués et identifiés au niveau méso ou macro-anatomique.

Cette technique présente un potentiel notable pour les études qui nécessitent une caractérisation phénotypique ex vivo détaillée de petits spécimens, tels que les embryons de souris, qui sont largement utilisés dans les plans expérimentaux⁶. Le contraste d’iode en combinaison avec l’imagerie micro-CT a été utilisé pour obtenir des quantifications volumétriques d’organes⁷ et de structures tridimensionnelles (3D) emblématiques ^8,9. Ces dernières années, la micro-tomodensitométrie d’échantillons colorés a été appliquée pour décrire les caractéristiques phénotypiques du cerveau des rongeurs¹⁰, et différentes améliorations de la technique ont été proposées. Pour les cerveaux adultes, un protocole de 48 h d’immersion dans l’iode, avec une étape préalable de perfusion avec un hydrogel, s’est avéré produire des images de haute qualité¹¹. Gignac et ^al.12 ont repoussé les limites de cette technique en montrant que des cerveaux de rats colorés à l’iode pouvaient être traités pour effectuer des techniques histologiques de routine. De même, ces procédures démontrent des résultats prometteurs pour les cerveaux de rongeurs embryonnaires et pré-sevrés 8,13,14,15.

Bien que les neurosciences aient largement appliqué des techniques basées sur le microscope pour évaluer différents aspects structurels et fonctionnels du développement du cerveau, de telles études sont plus adaptées à la caractérisation de populations cellulaires spécifiques ou de structures spatialement limitées. À l’inverse, l’imagerie micro-CT permet de décrire des structures entières et d’acquérir des modèles 3D qui préservent les informations spatiales pertinentes, ce qui est complémentaire aux techniques microscopiques. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est également une technique standard appliquée pour explorer les caractéristiques structurelles des petits animaux 16,17,18. Cependant, la micro-TDM, avec l’utilisation d’un agent de contraste, présente deux avantages principaux pour les échantillons fixés ex vivo : les scanners micro-CT sont largement moins coûteux et faciles à utiliser, et permettent une résolution spatiale plus élevée que l’IRM¹².

Ce travail vise à décrire la procédure permettant d’obtenir des images à haute résolution à partir de cerveaux de souris nouveau-nées à l’aide d’un micro-scanner après coloration avec la solution de Lugol, un agent de contraste à base d’iode. Un protocole complet est présenté, qui commence par des étapes préliminaires telles que le prélèvement d’échantillons et la fixation des tissus, et passe par la coloration, l’acquisition d’images micro-CT et le traitement standard. Le traitement d’images comprend la segmentation d’un volume 3D de la tête complète, ainsi que du cerveau, et la sélection de plans anatomiques spécifiques pour numériser les coordonnées des points qui pourraient ensuite être utilisés dans des analyses morphométriques. Bien que l’accent soit mis ici sur le cerveau de souris nouveau-né, des stratégies similaires peuvent être appliquées à d’autres tissus mous. Ainsi, le protocole présenté ici est suffisamment souple pour être appliqué, avec de subtiles modifications, à d’autres types d’échantillons.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont suivi les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux.

1. Prélèvement et préparation des échantillons

1. Préparer 500 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
   1. Sous un flux d’extraction dans une armoire, ajouter 20 g de poudre de PFA à 250 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un bécher en verre de 1 L. Placez le bécher avec un aimant sur une plaque d’agitation magnétique.
   2. Remuer en chauffant. À l’aide d’un thermomètre, vérifiez constamment la température de la solution pour la maintenir en dessous de 60 °C.
   3. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, ajouter des gouttes de 1 M de NaOH à la solution pour dissoudre le PFA. Une fois la poudre de PFA complètement dissoute, refroidissez la solution à température ambiante (RT).
   4. Réglez le volume à 500 ml avec 1x PBS. Ajustez le pH à 7,2-7,3 en ajoutant des gouttes de 1 M HCl avec une pipette Pasteur en plastique.
   5. À l’aide d’un filtre en papier et d’un entonnoir en verre, filtrez la solution dans une bouteille en verre de 1 L.
   6. Fermez la bouteille en verre, retirez-la de l’armoire à flux et conservez-la au réfrigérateur à -4 °C.
2. Prélevez des échantillons de cerveau.
   1. Pour obtenir des échantillons, sacrifiez des nouveau-nés de souris le matin suivant leur naissance, à l’âge de 0,5 jour (P 0,5), en utilisant des ciseaux chirurgicaux pour les décapiter.
   2. Placez les ciseaux dans le cou du nouveau-né tout en tenant le corps, et effectuez une seule coupe nette.
3. Fixez les échantillons dans PFA.
   1. Remplir un tube conique de 50 mL avec 40 mL de PFA à 4 %.
   2. Plongez chaque tête dans le tube contenant du PFA comme agent de fixation. Pour cette action, utilisez une spatule Paton ou une cuillère.
   3. Conserver les tubes coniques au réfrigérateur à -4 °C pendant 48 h, puis passer à 40 mL de 1x PBS avec 0,1 % d’azoture de sodium comme agent de conservation. Conserver au réfrigérateur à -4 °C.

2. Coloration de l’échantillon

1. Préparez la solution de Lugol (3,75 % p/v).
   1. Sous un flux d’extraction dans une armoire, dans un bécher en verre de 1 L, dissoudre 10 g de Kl et 5 g de I₂ dans 400 mL d’eau distillée, en mélangeant constamment à l’aide d’un agitateur magnétique.
2. Plongez chaque tête dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de solution de Lugol.
   1. Pour les nouveau-nés d’une taille approximative de 1,3 g, laisser les échantillons immergés pendant 15 à 20 h en mélangeant constamment à l’aide d’un agitateur orbital.
   2. Placer les échantillons dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL d’agarose à 1 % pendant 30 min avant de les scanner.

3. Micro-tomodensitométrie

REMARQUE : La micro-tomodensitométrie nécessite un équipement spécifique. Il existe différentes options pour ce type de scanner, et les détails de l’acquisition dépendent des caractéristiques de l’équipement utilisé. Le laboratoire du Dr Hallgrímsson compte sur certaines alternatives de micro-tomodensitomètres. Ici, le protocole est basé sur l’utilisation d’un scanner de bureau de base, qui est l’un des appareils d’imagerie des petits animaux les plus accessibles utilisés par les laboratoires du monde entier. Si l’objectif de l’examen est le crâne, sautez les étapes de la section 2 du protocole et passez à la section 3. Après avoir scanné le crâne, le processus de coloration et le balayage du cerveau ont pu être effectués pour obtenir des images à partir des mêmes spécimens du cerveau et du crâne.

1. Placez l’échantillon dans le support micro-CT.
   1. Placer l’échantillon dans un tube conique de 50 ml. Fixez l’échantillon pour éviter les mouvements pendant la session du scanner. À cette fin, un matériau en polyuréthane peut être utilisé pour remplir les parties vides du tube.
   2. Ouvrez l’équipement et placez le tube avec l’échantillon dans le support micro-CT.
   3. Connectez-vous au panneau de commande micro-CT et enregistrez l’échantillon à scanner. Cela générera automatiquement un numéro d’échantillon. En plus du numéro, remplissez le champ « Nom ». Le nom et le numéro de l’échantillon doivent être enregistrés ailleurs (p. ex., dans une feuille de calcul) au cas où les données brutes devraient être récupérées à nouveau.
   4. Lancez le programme d’analyse. Entrez le nom ou le numéro de l’échantillon et sélectionnez un fichier de contrôle , qui doit contenir les paramètres de balayage.
2. Scannez l’échantillon.
   1. Sur l’écran du logiciel micro-CT, définissez les paramètres suivants : taille de voxel isotrope de 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, temps d’intégration de 800 000 ms et 500 projections par 180°.
   2. Définissez la zone de numérisation en sélectionnant Vue Scout. Une fois que l’image de référence apparaît, appuyez sur Ligne de référence pour définir la région. Déplacez la ligne verte continue jusqu’au bord de l’échantillon, puis maintenez la touche Maj enfoncée tout en faisant glisser le curseur pour étendre la zone de balayage à l’autre bord de l’échantillon.
   3. Sélectionnez OK pour lancer l’analyse.
3. Évaluez et exportez l’analyse.
   1. Ouvrez le programme d’évaluation des micro-tomodensitomètres et cliquez sur Sélectionner un échantillon et une mesure. Dans le champ Filtre , saisissez le nom de l’échantillon, sélectionnez l’échantillon, puis sélectionnez le fichier de mesure.
   2. Le fichier se chargera sous forme de tranches, dont le nombre dépend de la fenêtre d’analyse initiale. Cliquez sur le bouton Charger tout , ce qui chargera chaque tranche et facilitera le mouvement entre les tranches par la suite.
   3. Sélectionnez Tâches > Évaluation 3D pour initialiser une zone de recadrage autour des tranches. Une invite d’évaluation 3D apparaîtra avec un certain nombre de champs, notamment Tâche/Évaluation, VOI (Volume of Interest), Début X, Y, Z et Dimension X, Y, Z.
   4. Définissez le champ Tâche > évaluation 3D sur le script approprié, car diverses tâches d’évaluation peuvent être effectuées, telles que la reconstruction, la segmentation, la morphométrie (par exemple, la densité minérale osseuse) et les conversions ou transferts de fichiers. Le script d’évaluation par défaut peut être utilisé comme guide.
   5. Après avoir sélectionné le script, ajustez la case VOI sur l’image principale. Commencez par la première tranche. Assurez-vous que la boîte contient l’anatomie à évaluer. Déplacez la VOI en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’un des petits carrés blancs vers le bord de la boîte et en redimensionnant la VOI à l’aide du bouton central de la souris. Vous pouvez également ajuster les champs de dimension numériquement.
   6. Parcourez l’échantillon à l’aide de la barre de défilement sous l’image pour vous assurer que toutes les anatomies ont été capturées dans la boîte VOI. Cliquez sur XY, XZ ou YZ en haut à gauche du logiciel pour modifier l’orientation.
   7. Sélectionnez Démarrer l’évaluation. Selon le script d’évaluation des tâches, cela générera un fichier image 3D .aim avec un fichier d’en-tête .txt correspondant. De plus, un chemin peut être spécifié dans le script vers le protocole FTP (File Transfer Protocol) de l’image vers un emplacement particulier.

4. Traitement d’image

1. Ouvrez les images dans le logiciel de traitement d’image.
   REMARQUE : Le traitement d’image peut être effectué à l’aide de différents logiciels. Ce protocole comprend les étapes de base d’un logiciel commercial, qui est largement accepté dans la région et dispose d’outils polyvalents pour le traitement de base et avancé. De plus, il existe différents formats acceptables pour les images micro-tomodensitométriques reconstruites. Cet aspect dépend généralement de l’équipement utilisé pour l’acquisition et de son logiciel. Ici, le traitement d’image est effectué avec .bmp images. La même procédure peut être appliquée pour les images .tiff et d’autres types. Comme l’acquisition est effectuée dans un scanner avec .aim comme format par défaut, une conversion de .aim en .bmp est d’abord présentée.
   1. Pour ouvrir les fichiers .aim, sélectionnez Fichier > Données ouvertes et choisissez le fichier. Après cela, une fenêtre intitulée Sélection du format de fichier s’ouvrira. Sélectionnez Données brutes.
   2. Une fenêtre intitulée Paramètres des données brutes s’ouvre. Dans cette fenêtre, renseignez les paramètres en suivant les informations du fichier .txt d’en-tête généré pour chaque fichier .aim. Pour Type de données, choisissez 16 bits pour l’en-tête complet avec le nombre après Les données d’image commencent au décalage d’octet. Définissez également les dimensions et la taille du voxel à l’aide des informations figurant dans le fichier .txt d’en-tête. Une fois les paramètres terminés, appuyez sur OK.
   3. Si une conversion de .aim en .bmp est nécessaire, dans le panneau principal > la vue Projet, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objet .aim et sélectionnez l’option Convertir > Convertir le type d’image. Dans Propriétés, sélectionnez 8 bits comme type de sortie. Sélectionnez Appliquer.
   4. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le nouvel objet 8 bits. Sélectionnez Enregistrer sous. Choisissez .bmp et enregistrez.
   5. Pour ouvrir le fichier .bmp, sélectionnez Fichier > Open Data et choisissez le fichier. Après cela, une fenêtre avec les paramètres de l’image s’ouvre. Confirmez les paramètres et acceptez-les s’ils sont corrects.
   6. Dans le panneau principal > la vue Projet, un nouvel objet est créé avec le nom des fichiers .bmp. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur cet objet et sélectionnez l’option Ortho Slice. Dans Propriétés, sélectionnez le numéro de tranche et le plan d’orientation à afficher.
2. Obtenez des volumes 3D de la tête complète.
   1. Dans le panneau principal > la vue Projet, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objet image. Sélectionnez l’option Seuillage interactif > Créer. Dans Propriétés, modifiez les valeurs de RVB minimum et RVB maximum jusqu’à ce que la partie de l’image correspondant à la tête de l’animal soit sélectionnée. Sélectionnez Appliquer.
   2. Dans le panneau principal > la vue Projet, un objet seuillé est créé. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur cet objet et, dans Propriétés, sélectionnez Isosurface. Dans Propriétés, choisissez un seuil pour visualiser la surface et cliquez sur Appliquer. Ce seuil doit être choisi empiriquement, puis différentes valeurs peuvent devoir être examinées.
3. Numérisation des coordonnées des points
   1. Les coordonnées des points 3D peuvent être numérisées à la fois sur la base de tranches ou de surfaces extraites. Pour la première option, cliquez avec le bouton droit de la souris dans l’option d’image et sélectionnez Trancher. Dans Translate, choisissez la tranche souhaitée dans le plan axial. Si le plan n’est pas correctement placé, cliquez sur Options > Rotation dans Propriétés pour définir la bonne orientation.
   2. Pour numériser des points de repère, cliquez avec le bouton droit de la souris dans le panneau principal > la vue du projet et sélectionnez Créer des points de > d’objets et des lignes > des points de repère. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les nouveaux repères d’objet et sélectionnez Vue de repère. Dans la vue Repère, modifiez la taille du point dans Taille. Pour ajouter des points de repère dans Propriétés, utilisez l’option Ajouter en mode Édition.
      REMARQUE : Pour les nouveau-nés, un ensemble de points de repère et de semi-points de repère autour des courbes axiales et sagittales du cerveau a été publié^{précédemment 14}.
   3. Tout d’abord, choisissez le plan axial qui traverse le point le plus rostral des bulbes olfactifs et le point le plus caudal du cortex.
   4. Sélectionnez les points de repère de l’objet et, dans Propriétés, sélectionnez Éditeur de points de repère. À l’aide de la flèche, cliquez sur l’endroit où le point doit être numérisé.
   5. Dans l’ensemble de repères proposé, 24 points sont numérisés dans le plan axial sélectionné. Numérisez le premier dans le point le plus caudal du cerveau sur la ligne médiane.
   6. Numérisez cinq points répartis également autour de la courbe (semi-repères) jusqu’au prochain point de repère à l’intersection entre le mésencéphale et le cortex.
   7. Ensuite, numérisez huit points (semi-repères) autour du cortex.
   8. Numériser un nouveau repère à l’intersection entre le cortex et les bulbes olfactifs. Ensuite, numérisez quatre points (semi-repères) autour des bulbes olfactifs.
   9. Numérisez un nouveau repère au point le plus rostral des bulbes olfactifs sur la ligne médiane. Ensuite, numérisez deux points (semi-points de repère) entre les deux bulbes olfactifs.
   10. Numérisez un nouveau repère au point le plus caudal des bulbes olfactifs sur la ligne médiane.
   11. Pour les points sagittals, établissez une tranche dans le côté droit du cerveau à un plan parasagittal où le cerveau est le plus proéminent sur le plan caudal.
   12. Dans l’ensemble de points de repère proposé, 33 points sont numérisés dans le plan parasagittal sélectionné. Numérisez le premier à l’intersection entre le diencéphale et le cerveau postérieur. Ensuite, numérisez neuf points (semi-repères) dans la limite ventrale du cerveau.
   13. Numériser un nouveau repère au point le plus rostral du bulbe olfactif. Ensuite, numérisez trois points (semi-repères) autour des bulbes olfactifs.
   14. Numériser un nouveau repère à l’intersection entre le bulbe olfactif et le cortex. Ensuite, numérisez trois points (semi-repères) autour des bulbes olfactifs.
   15. Numériser un nouveau repère à l’intersection entre le bulbe olfactif et le cortex. Ensuite, numérisez sept points (semi-points de repère) autour du cortex.
   16. Numérisez un nouveau point de repère à l’intersection entre le cortex et le mésencéphale. Ensuite, numérisez sept points (semi-points de repère) autour du cortex.
   17. Numérisez un nouveau point de repère à l’intersection entre le cortex et le mésencéphale. Ensuite, numérisez six points (semi-points de repère) autour du mésencéphale.
   18. Numériser un nouveau point de repère à l’intersection entre le mésencéphale et le cervelet. Ensuite, numérisez deux points (semi-repères) autour du cervelet.
   19. Numérisez un nouveau point de repère à l’intersection entre le cervelet et le cerveau postérieur.
   20. Enregistrez les points numérisés. Faites un clic droit sur les points de repère de l’objet et choisissez l’option Enregistrer les données.
4. Analysez les coordonnées des points.
   NOTE : Une fois les coordonnées des points numérisées pour un ensemble de spécimens, des analyses de base peuvent être effectuées à l’aide d’outils de morphométrie géométrique pour obtenir des variables de taille (taille du centroïde) et de forme (forme ou coordonnées de Procuste). Les analyses sont effectuées dans un environnement logiciel libre et ouvert, particulièrement adapté aux analyses statistiques.
   1. À l’aide d’un bloc-notes, constituez un fichier contenant les coordonnées de tous les spécimens numérisés. Pour cela, suivez le format TPS, tel que décrit dans https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
   2. Ouvrez le logiciel statistique. Sélectionnez Fichier > Modifier le répertoire pour choisir le répertoire dans lequel le fichier .tps est enregistré.
   3. Sélectionnez Packages > Installer des packages. Choisissez un miroir Cran. Cherchez géomorph et installez-le.
   4. Chargez les paquets en tapant dans la console : library(geomorph) et library(Morpho).
   5. Chargez le jeu de données en tapant dans la console : dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps », specID="ID »).
   6. Effectuez une analyse généralisée de Procuste en tapant dans la console : GPA<- gpagen(dataset).
   7. Obtenez la taille du centroïde en tapant dans la console : CS<-GPA$Csize.
   8. Obtenez les coordonnées de Procuste en tapant dans la console : ProcCoord<- GPA$coords.
   9. Tracez les coordonnées de Procuste et la forme moyenne en tapant dans la console : plotAllSpecimens(ProcCoord).
5. Segmentation des retours sur investissement
   NOTE : Pour segmenter le cerveau et obtenir une reconstruction 3D, identifiez manuellement les tissus cérébraux dans chaque tranche. La même procédure peut être appliquée à des zones d’intérêt spécifiques, telles que les bulbes olfactifs, le cortex, etc.
   1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur Panneau principal > Vue du projet et sélectionnez Créer un objet > un champ d’étiquette.
   2. En sélectionnant l’objet Champ d’étiquette , appuyez sur l’option Éditeur de segmentation dans Propriétés.
   3. Dans Matériaux, ajoutez un nouveau matériau et, si vous le souhaitez, renommez-le en Cerveau.
   4. Dans Sélection, choisissez l’option Tranche actuelle pour segmenter le tissu correspondant au cerveau dans chaque tranche.
   5. À l’aide des options présentes dans Outils, sélectionnez le tissu cérébral dans chaque tranche. Dans ce cas, la baguette magique et le pinceau sont les plus appropriés.
   6. Une fois la sélection effectuée dans chaque tranche, appuyez sur Ajouter à la sélection.
   7. Lorsque la sélection dans toutes les tranches est terminée, revenez à la vue Projet dans le panneau principal et cliquez avec le bouton droit de la souris sur Champ d’étiquette pour sélectionner Générer la surface, puis cliquez sur Appliquer.
   8. Une fois la surface obtenue, exportez-la en appliquant Extraire la surface.
   9. Pour obtenir le volume des structures segmentées, dans le panneau principal > la vue Projet, sélectionnez l’objet qui contient l’étiquette, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Mesurer et analyser > fraction volumique. Cliquez ensuite sur Appliquer.

Résultats

Ici, un protocole de base pour obtenir des images à haute résolution du cerveau de souris nouveau-nées est présenté. Les têtes ont été scannées après immersion dans la solution de Lugol. Malgré leur petite taille, les principales structures anatomiques du cerveau, telles que les bulbes olfactifs, le cortex, le mésencéphale, le cervelet et le cerveau postérieur, peuvent être distinguées (Figure 1).

Différentes analyses peuvent être effectuées à ...

Discussion

Dans ce travail, un protocole concis pour scanner les tissus cérébraux néonatals de souris à l’aide d’une micro-tomodensitométrie avec un agent de contraste est introduit. En outre, il comprend des procédures simples pour obtenir des résultats quantitatifs et qualitatifs. Sur la base de ces méthodes, d’autres analyses alternatives ou complémentaires peuvent être effectuées.

Comme le montre le protocole, les images micro-CT peuvent être analysées de différentes manières. Da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650