Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi

Özet

Bu çalışma, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve ex vivo örneklerde bir kontrast maddeyi birleştirerek yenidoğan fare beyinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme adımlarını açıklamaktadır. Bu görüntülerde beyin boyutunu ve şeklini ölçmek için temel morfometrik analizleri açıklıyoruz.

Özet

Nörogörüntüler, hayvan modelleri kullanılarak yapılan deneylerde beyin morfolojisini incelemek için değerli bir araçtır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), yumuşak dokular için standart yöntem haline gelmiştir, ancak düşük uzamsal çözünürlüğü küçük hayvanlar için bazı sınırlar oluşturmaktadır. Burada, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) kullanarak fare yenidoğan beyinleri ve kafatasları hakkında yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) bilgi elde etmek için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, numuneleri incelemek, beyni boyamak ve taramak ve tüm organ ve ilgilenilen bölgelerin (ROI'ler) morfometrik ölçümlerini elde etmek için gereken adımları içerir. Görüntü analizi, yapıların segmentasyonunu ve nokta koordinatlarının sayısallaştırılmasını içerir. Özetle, bu çalışma, mikro-BT ve Lugol solüsyonunun kontrast madde olarak kombinasyonunun, küçük hayvanların perinatal beyinlerini görüntülemek için uygun bir alternatif olduğunu göstermektedir. Bu görüntüleme iş akışı, gelişim biyolojisi, biyotıp ve çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin beyin gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirmekle ilgilenen diğer bilimlerde uygulamalara sahiptir.

Giriş

Mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) görüntüleme, farklı araştırma alanları için değerli bir araçtır. Biyolojide, mineralize dokularda X-ışını emilimi nedeniyle özellikle kemik araştırmaları için uygundur. Bu özellik nedeniyle, diğer konuların yanı sıra kemik gelişimi¹, metabolizma² ve evrim ^3,4 ile ilgili çeşitli sorulara mikro-BT yardımıyla yaklaşılmıştır. 2008 yılında, de Crespigny ve ^ark.5, yetişkin fare ve tavşan beyinlerinin mikro-BT görüntülerinin kontrast madde olarak iyot kullanılarak elde edilebileceğini ....

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerini takip etti.

1. Numune toplama ve hazırlama

1. 500 mL% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
   1. Bir kabindeki ekstraksiyon akışı altında, 1 L'lik bir cam beherde 250 mL 1x fosfat tamponlu saline (PBS) 20 g PFA tozu ekleyin. Mıknatıslı kabı manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin.
   2. Isıtırken karıştırın. Bir termometre ile, çözeltinin sıcaklığını 60 °C'nin altında tutmak için sürekli kontrol edin.
   3. Plastik bir Pastör pipeti ile PFA'yı çözmek için çözeltiye 1 M NaOH damlası ekleyin. PFA tozu tamamen çözüldüğünde, çözeltiyi....

Tartışmalar

Bu çalışmada, mikro-BT kullanarak farelerin yenidoğan beyin dokularını kontrast madde ile taramak için özlü bir protokol tanıtılmıştır. Ek olarak, nicel ve nitel çıktılar elde etmek için basit prosedürler içerir. Bu yöntemlere dayanarak, daha fazla alternatif veya tamamlayıcı analiz yapılabilir.

Protokolde gösterildiği gibi, mikro-BT görüntüleri farklı şekillerde analiz edilebilir. Önceki çalışmalarda grubumuz, noktaların koordinatlarını sayısallaştırar.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650