هنا ، نصف تصميم محرك الأقراص الصغير ، وإجراء الزرع الجراحي ، واستراتيجية التعافي بعد الجراحة التي تسمح بتسجيلات الحقل المزمن والوحدة الواحدة من مناطق الدماغ المتعددة في وقت واحد في الفئران الأحداث والمراهقين عبر نافذة تنموية حرجة من يوم ما بعد الولادة 20 (p20) إلى يوم ما بعد الولادة 60 (p60) وما بعده.
يوفر الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي نظرة ثاقبة لا مثيل لها في ديناميكيات الدوائر دون المستوى الثاني للدماغ السليم ويمثل طريقة ذات أهمية خاصة لدراسة نماذج الفئران للاضطرابات العصبية والنفسية البشرية. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب غرسات جمجمية كبيرة ، والتي لا يمكن استخدامها في الفئران في نقاط زمنية مبكرة من النمو. على هذا النحو ، لم يتم إجراء أي دراسات تقريبا لعلم وظائف الأعضاء في الجسم الحي على الفئران الرضع أو الأحداث التي تتصرف بحرية ، على الرغم من حقيقة أن الفهم الأفضل للتطور العصبي في هذه النافذة الحرجة من المرجح أن يوفر رؤى فريدة حول اضطرابات النمو المعتمدة على العمر مثل التوحد أو الفصام. هنا ، يتم وصف تصميم محرك الأقراص الصغير ، وإجراء الزرع الجراحي ، واستراتيجية التعافي بعد الجراحة التي تسمح بتسجيلات المجال المزمن والوحدة الواحدة من مناطق الدماغ المتعددة في وقت واحد في الفئران مع تقدمهم في العمر من يوم ما بعد الولادة 20 (p20) إلى يوم ما بعد الولادة 60 (p60) وما بعده ، نافذة زمنية تتوافق تقريبا مع الأعمار البشرية من عامين حتى مرحلة البلوغ. يمكن تعديل وتوسيع عدد أقطاب التسجيل ومواقع التسجيل النهائية بسهولة ، مما يسمح بالتحكم التجريبي المرن في المراقبة في الجسم الحي لمناطق الدماغ ذات الصلة بالسلوك أو المرض عبر النمو.
يخضع الدماغ لتغييرات واسعة النطاق خلال النوافذ التنموية الحرجة للطفولة والمراهقة1،2،3. تظهر العديد من الأمراض العصبية والنفسية ، بما في ذلك التوحد والفصام ، لأول مرة سلوكيا وبيولوجيا خلال هذه الفترة من نمو دماغ الأحداث والمراهقين4،5،6. في حين أن الكثير معروف فيما يتعلق بالتغيرات الخلوية والمشبكية والجينية التي تحدث عبر التطور المبكر ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل نسبيا فيما يتعلق بكيفية تغير العمليات على مستوى الدائرة أو الشبكة خلال هذه النافذة الزمنية. الأهم من ذلك ، أن وظيفة الدماغ على مستوى الدائرة ، والتي تكمن في النهاية وراء السلوكيات المعقدة والذاكرة والإدراك ، هي خاصية ناشئة لا يمكن التنبؤ بها للوظيفة الخلوية والمشبكية7،8،9،10. وبالتالي ، لفهم وظائف الدماغ على مستوى الشبكة بشكل كامل ، من الضروري دراسة النشاط العصبي مباشرة على مستوى الدائرة العصبية السليمة. بالإضافة إلى ذلك ، لتحديد كيفية تغيير نشاط الدماغ طوال تطور الاضطرابات العصبية والنفسية ، من الأهمية بمكان فحص نشاط الشبكة في نموذج مرض صالح خلال النافذة الزمنية المحددة عندما تظهر الأنماط الظاهرية السلوكية للمرض وتتبع التغييرات الملحوظة أثناء استمرارها في مرحلة البلوغ.
يعد الفأر أحد أكثر الكائنات النموذجية العلمية شيوعا وقوة ، مع وجود أعداد كبيرة من السلالات الجينية الفريدة التي تمثل اضطرابات النمو العصبي مع بداية تعتمد على العمر للأنماط الظاهرية السلوكية و / أو ذاكري 11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21. في حين أنه من الصعب ربط النقاط الزمنية التنموية الدقيقة بين أدمغة البشر والفئران ، تشير المقارنات المورفولوجية والسلوكية إلى أن الفئران p20-p21 تمثل الأعمار البشرية من 2-3 سنوات ، وتمثل الفئران p25-p35 الأعمار البشرية من 11-14 سنة ، مع احتمال وصول الفئران إلى المكافئ التنموي لشخص بالغ يبلغ من العمر 20 عاما بواسطة p603 ، 22. وبالتالي ، لفهم كيفية تطور دماغ الأحداث بشكل أفضل وتحديد كيف تصبح الشبكات العصبية للدماغ مختلة وظيفيا في أمراض مثل التوحد أو الفصام ، سيكون من المثالي مراقبة نشاط الدماغ مباشرة في الجسم الحي في الفئران عبر الأعمار من 20 يوما إلى 60 يوما.
ومع ذلك ، فإن التحدي الأساسي في مراقبة نشاط الدماغ عبر التطور المبكر في الفئران هو صغر حجم الفئران اليافعة وضعفها النسبي. عادة ما يتطلب الزرع المزمن للأنقيب الكهربائية ، وهو أمر ضروري للدراسات الطولية لنمو الدماغ ، غلافا كبيرا وضخما لحماية أسلاك القطب الدقيقة ولوحات الواجهة23،24 ، ويجب أن تكون الغرسات متصلة بإحكام بجمجمة الفأر ، وهي أرق وأقل صلابة في الفئران الصغيرة بسبب انخفاض التعظم. وهكذا ، تم إجراء جميع الدراسات تقريبا لفسيولوجيا القوارض في الجسم الحي في الأشخاص البالغين بسبب حجمها النسبي وقوتها وسمك جمجمتها. حتى الآن ، تم إجراء معظم الدراسات التي تستكشف فسيولوجيا دماغ القوارض اليافعة في الجسم الحي في الفئران اليافعة من النوع البري ، مما يحد بالضرورة من القدرة على مراقبة وظائف دماغ الأحداث تجريبيا في نموذج يتصرف بحرية لاضطراب بشري 25،26،27،28،29،30.
تصف هذه المخطوطة السكن الجديد للزرع ، وإجراء الزرع الجراحي ، واستراتيجية التعافي بعد الجراحة لدراسة وظائف الدماغ طويلة المدى (حتى 4 أسابيع أو أكثر) في الجسم الحي للفئران اليافعة عبر نافذة زمنية حرجة من الناحية التنموية (p20 إلى p60 وما بعدها). يسمح إجراء الزرع بالتثبيت الموثوق والدائم للأقطاب الكهربائية على جماجم الفئران اليافعة. علاوة على ذلك ، فإن تصميم محرك الأقراص الصغير خفيف الوزن ، حيث يزن هذا المحرك الصغير ~ 4-6 جم عند تجميعه بالكامل ، وبسبب الحد الأدنى من الموازنة المطلوبة لتعويض وزن الغرسة ، فإنه لا يؤثر على الأداء السلوكي للفئران اليافعة خلال النماذج السلوكية النموذجية.
تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة للمركز الطبي بجامعة تكساس الجنوبية الغربية (البروتوكول 2015-100867) وتم إجراؤها وفقا لكل من المبادئ التوجيهية المؤسسية والمعهد الوطني للصحة. تم زرع الفئران الذكور والإناث C57 / Bl6 المستخدمة في الدراسة الحالية في p20 (الوزن 8.3-11.1 جم في وقت الزرع).
1. تصميم وبناء محرك الأقراص الصغيرة
2. الزرع الجراحي
3. التعافي بعد الجراحة
تم استخدام البروتوكول الموصوف أعلاه لتسجيل إشارات المجال المحلي المحتملة والوحدات الفردية من مناطق الدماغ المتعددة في وقت واحد في الفئران ، مع إجراء تسجيلات يومية في نفس الفئران من p20 إلى p60. تم الإبلاغ هنا عن تسجيلات فسيولوجية كهربية تمثيلية من فأرين وأنسجة ما بعد التجربة توضح مواقع التسجيل النهائية.
الزرع الجراحي للمحرك الصغير في فئران p20
تم إنشاء محرك أقراص صغير (الشكل 1) (الشكل 2) وزرعه جراحيا في ماوس p20 ، كما هو موضح أعلاه. بعد الجراحة مباشرة ، تم ربط الماوس بنظام الموازنة (الشكل 2G-I) وسمح له بالتعافي. بمجرد أن أصبح الماوس متحركا بالكامل ، تم توصيل محرك الأقراص الصغير بنظام تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي. تم تعليق الكابلات التي تربط محرك الأقراص الصغير بجهاز التسجيل فوق الماوس. تم الحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية (32 كيلو هرتز) عبر جميع القنوات لمدة 1 ساعة بينما تصرف الفأر بشكل طبيعي في قفصه المنزلي. بعد التسجيل ، تم فصل الماوس عن نظام التسجيل ، وإعادة توصيله بنظام الموازنة ، وعاد إلى حظيرة الحيوان مع حرية الوصول إلى الماء والشو.
التسجيل اليومي للنشاط العصبي
تم الحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية يوميا لعدة أسابيع لتمكين المراقبة المزمنة لنفس منطقة الدماغ عبر النوافذ التنموية الحرجة ل p20-p60. يتم عرض عينة من إمكانات الحقل المحلي الخام (LFP) من عبر التسجيلات المزمنة في الشكل 3A ، C. تم الحصول على وحدات مفردة معزولة في وقت واحد من رباعيات متعددة (الشكل 3 ب). تم تحديد الوحدات ذات الأشكال الموجية المتشابهة عبر عدة أيام (الشكل 3B ، الوسط واليمين) ، ولكن نظرا للانجراف المحتمل لقطب التسجيل ، لم يكن من الممكن الادعاء بشكل قاطع أنه تم تحديد نفس الوحدة عبر الأيام. في فأر منفصل تم زرعه في p20 وتم تسجيله يوميا لعدة أسابيع ، تم فحص النشاط العصبي على رباعي يستهدف المنطقة الظهرية CA1. تم تحديد تموجات كبيرة السعة ووحدات مفردة معزولة جيدا في كل يوم من أيام التسجيل (الشكل 4). تشير هذه البيانات إلى أن التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية المستقرة وعالية الجودة في الجسم الحي يمكن أن تكون من نفس الفأر عبر التطور المبكر.
التأكيد النسيجي لمواقع التسجيل والتأثير التنموي للزرع المزمن
بعد يوم التسجيل الأخير ، تم تخدير الفأر تماما عن طريق تخدير الأيزوفلوران متبوعا بحقنة قاتلة من الصوديوم البنتوباربيتال ، وتم تمرير تيار عبر أطراف القطب لإنتاج آفات صغيرة في مواقع التسجيل. سمح التقسيم النسيجي بعد التجربة لدماغ الفأر بتصور مواقع التسجيل النهائية (الشكل 5 أ ، ب). في مجموعة منفصلة ، تم زرع ثلاثة ذكور وثلاث إناث من الفئران جراحيا في p20 كما هو موضح أعلاه. تم ترك أعداد متساوية من رفقاء القمامة دون زرع والحفاظ عليها في ظروف سكنية متطابقة. تم التضحية بالفئران في p62 (6 أسابيع بعد الجراحة للمجموعة المزروعة). تم تنظيف الجماجم بعناية ، وتم أخذ قياسات خارجية لمسافة بريجما إلى لامدا (الشكل 5C ، أعلى اليسار) وعرض الجمجمة الأقصى الخارجي عند لامدا (الشكل 5C ، أعلى اليمين). تم إجراء شق على طول خط الوسط من الجمجمة ، وتمت إزالة نصف الجمجمة لاستئصال الدماغ لقياس الكتلة (الشكل 5C ، أسفل اليمين). تم قياس ارتفاع تجويف الجمجمة في bregma من نصف الجمجمة السليم (الشكل 5C ، أسفل اليسار). لم يكن هناك مقياس يختلف اختلافا كبيرا بين الأفواج المزروعة وغير المزروعة (اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون) ، مما يشير إلى أن الزرع طويل الأمد ، بدءا من p20 ، ليس له تأثير جسيم على التطور الطبيعي للجمجمة أو حجم الدماغ.
الشكل 1: مكونات محرك الأقراص الصغيرة. عروض ثلاثية الأبعاد لجسم محرك الأقراص الصغير (A) ، (B) القنية ، (C) المخروط ، (D) الغطاء ، (E) الملحقات اللولبية ، و (F) المسمار اللولبي المتقدم. يشار إلى الميزات الهامة لكل مكون. يمكن استخراج تفاصيل القياس من ملفات النموذج المتوفرة في https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بناء محرك الأقراص الصغير . (A) منظر جانبي و (B) علوي للبرغي المتقدم رباعي الرؤوس مع توصيل ملحقات المسمار العلوي والسفلي. (ج) منظر جانبي و (د) علوي للمحرك الصغير مع توصيل الجسم والقنية وأنبوب بوليميد كبير يمر عبر كل فتحة قنية ومشذب إلى أسفل القنية. ( ه) منظر جانبي للمحرك الصغير مع وجود البراغي وأنابيب البولي ميد الصغيرة في مكانها. يتم قطع قمم أنابيب البوليميد الصغيرة مباشرة قبل تحميل رباعي. (و) محرك ميكرو مكتمل متصل بجهاز التجسيم. تمت إزالة المخروط الواقي الذي يحيط عادة بمحرك الأقراص الصغير لأغراض التصور. لاحظ أن بعض الملحقات اللولبية تمت طباعتها في راتينج أسود لمحرك الأقراص الصغير هذا. (ز) نظام دعم الموازنة. (ح) منظر جانبي و (I) علوي لقفص الماوس مع توصيل نظام دعم الموازنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية التمثيلية. تم زرع ماوس p20 بمحرك أقراص صغير كما هو موضح أعلاه. بدءا من p21 وكل يوم بعد ذلك لمدة أسبوعين ، تم توصيل الماوس بجهاز التسجيل ، وتم تسجيل النشاط العصبي لمدة 1 ساعة على الأقل. (أ) تسجيلات إمكانات المجال المحلي الخام (LFP) من الثنائية (L = اليسار ؛ R = يمين) القشرة الحزامية الأمامية (ACC) ، منطقة الحصين CA3 (CA3) ، ومنطقة الحصين CA1 (CA1). تم جمع البيانات كل يوم. للتوضيح ، يتم عرض البيانات من الأيام الفردية فقط. تم أخذ جميع الآثار خلال فترات الجمود في قفص المنزل. شريط المقياس: 1 مللي فولت ، 2 ثانية. (B) وحدات فردية تمثيلية معزولة من منطقة الحصين CA3 (يسار) و CA1 (يمين) للتسجيلات في اللوحة A. تظهر جميع أشكال الموجات الخام على كل قطب كهربائي باللون الأسود ؛ المتوسط باللون الأحمر. شريط المقياس: 50 ميكروفولت ، 0.2 مللي ثانية. (C) تتبع LFP الخام التمثيلي لكل يوم 10 حتى يوم التسجيل النهائي في p60 للماوس الثاني المزروع في p20. تم جمع البيانات كل يوم. للتوضيح ، يتم عرض البيانات فقط من كل يوم 10. تم أخذ جميع الآثار خلال فترات الجمود في قفص المنزل. شريط المقياس: 1 مللي فولت ، 2 ثانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. استقرار التسجيلات المزمنة. تم زرع ماوس p20 بمحرك أقراص صغير ، كما هو موضح أعلاه. بدءا من p21 وبعد ذلك لمدة 4 أسابيع ، تم توصيل الماوس بجهاز التسجيل ، وتم تسجيل النشاط العصبي لمدة 1 ساعة على الأقل. تظهر بيانات من رباعيات تستهدف الحصين الظهري CA1. (أ) LFP الخام (العلوي) والمفلتر بالتموج (السفلي) لأحداث التموج المحددة في p21 و p30 و p40. لتحديد أحداث التموج ، تم ترشيح LFP الخام لتمرير النطاق بين 125 هرتز و 300 هرتز ، وتم تحديد أحداث التموج على أنها زيادات عابرة في قدرة نطاق التموج أكبر من 3 انحرافات معيارية فوق المتوسط. تم تعريف بداية ونهاية كل تموج على أنها النقطة التي عادت فيها قوة نطاق التموج إلى المتوسط. تظهر التموجات المحددة باللون الأحمر. شريط المقياس: 100 مللي ثانية ، من أعلى إلى أسفل: 1000 ميكروفولت ، 140 ميكروفولت ، 1800 ميكروفولت ، 180 ميكروفولت ، 9000 ميكروفولت ، 1200 ميكروفولت ، 10000 ميكروفولت ، 1000 ميكروفولت. (ب) وحدة مفردة تمثيلية من كل يوم من رباعي CA1 المستهدف للتسجيلات في اللوحة أ. تظهر جميع أشكال الموجات الخام على كل قطب كهربائي باللون الأسود ؛ المتوسط باللون الأحمر. شريط المقياس 0.2 مللي ثانية ، من أعلى إلى أسفل: 50 ميكروفولت ، 100 ميكروفولت ، 100 ميكروفولت. (ج) مخطط تلقائي لجميع المسامير للوحدات المفردة في اللوحة باء. توضح هذه البيانات وضع القطب الكهربائي المستقر داخل الطبقة الهرمية الحصين على مدار عدة أسابيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الأنسجة التمثيلية وتأثيرها على نمو الجمجمة. تم زرع ماوس p20 بمحرك أقراص صغير ، كما هو موضح أعلاه. بعد يوم التسجيل النهائي على p60 ، تم إنتاج آفات التحليل الكهربائي في مواقع التسجيل ، وتم ترشيح الدماغ بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد. لتحديد مواقع التسجيل ، تم إنتاج أقسام 50 ميكرومتر. أ: الآفات في CA1 و CA3 من الحصين. يشير رأس السهم إلى موقع تسجيل CA3 ؛ يشير رأس السهم المزدوج إلى موقع تسجيل CA1. شريط المقياس: 0.5 مم. (ب) الآفات في ACC الثنائية. تشير رؤوس الأسهم إلى مواقع تسجيل ACC. شريط المقياس: 0.5 مم. (C) قياسات حجم الجمجمة وكتلة الدماغ للفئران p62 المزروعة بمحرك صغير عند p20 (رمادي) والقمامة غير المزروعة (بيضاء). يتم الإبلاغ عن القيمة p لاختبار مجموع رتبة ويلكوكسون لكل قياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
غالبا ما تستخدم التجارب الحديثة التي تستكشف وظيفة الدائرة العصبية في الجسم الحي في القوارض الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية عبر أقطاب كهربائية مزروعة بشكل دائم لمراقبة نشاط الخلايا العصبية الفردية (أي الوحدات الفردية) أو السكان المحليين (عبر إمكانات المجال المحلي ، LFP) ، ولكن نادرا ما يتم تطبيق هذه الأساليب على الفئران اليافعة بسبب التحديات التقنية. تصف هذه المخطوطة طريقة للحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي في الفئران عبر النوافذ الحرجة من الناحية التنموية من p20 إلى p60 وما بعدها. تتضمن هذه المنهجية عملية تصنيع لطباعة وبناء غرسة محرك أقراص صغيرة ، وإجراء زرع جراحي ، واستراتيجية تعافي ما بعد الجراحة ، وكلها مصممة خصيصا للاستخدام في الفئران اليافعة. كانت هناك عدة اعتبارات مؤثرة في تطوير هذا البروتوكول ، بما في ذلك صغر حجم الفئران اليافعة وضعفها النسبي مقارنة بنظيراتها البالغة ، فضلا عن انخفاض تعظم جمجمة الفأر اليافعة التي يجب ربط محرك الأقراص الصغير بها.
طريقتان أساسيتان تستخدمان بشكل شائع لأداء الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي هما صفائف الأقطاب الكهربائية (على سبيل المثال ، رباعي الترودات) ومجسات السيليكون. مجسات السيليكون خفيفة الوزن ، ويمكن أن توفر عددا كبيرا من مواقع التسجيل لكل وحدة وزن ، وقد تم استخدامها سابقا في الفئراناليافعة 25. ومع ذلك ، فإن مجسات السيليكون باهظة الثمن نسبيا لكل وحدة. في المقابل ، يمكن إنشاء محرك الأقراص الصغير الموصوف في هذه المخطوطة باستخدام أقل من 50 دولارا أمريكيا من المواد الخام ، مما يجعله خيارا فعالا من حيث التكلفة للتسجيل في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يجب في كثير من الأحيان زرع مجسات السيليكون في خطوط ثابتة ، مما يحظر تسجيل مناطق الدماغ المتنوعة مكانيا. في المقابل، يستخدم تصميم محرك الأقراص الصغير الموصوف في هذه المخطوطة رباعيات قابلة للتعديل بشكل مستقل لاستيعاب التسجيلات المتزامنة في ما يصل إلى 16 موقعا مختلفا دون أي قيود تقريبا على العلاقة المكانية بين تلك المواقع. يمكن تعديل تصميم محرك الأقراص الصغير هذا بسهولة للسماح باستهداف مواقع مختلفة عن تلك الموضحة هنا عن طريق تحريك بثق فتحة القنية إلى أي موقع أمامي / خلفي ووسطي / بعيد مرغوب. عند استهداف مناطق الدماغ البديلة ، من المهم ملاحظة أنه في حين أن tetrodes غالبا ما تنتقل بشكل مستقيم ، فمن الممكن أن تنحرف هذه الأسلاك الرفيعة قليلا عند خروجها من قنية محرك الأقراص الصغيرة. وبالتالي ، كلما كانت منطقة الدماغ أصغر أو أكثر بطنية ، كلما كان من الصعب استهداف المنطقة بنجاح باستخدام رباعيات الترودات.
تشبه غرسة محرك الأقراص الصغيرة الموصوفة في هذه المخطوطة بشكل أساسي العديد من تصميمات محركات الأقراص الصغيرة السابقة القائمة على رباعي 23،32،33،34،35 من حيث أن tetrodes الفردية مثبتة على مسامير ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في عمق التسجيل لكل رباعي. في حين أن العديد من ميزات تصميم محرك الأقراص الصغير الحالي فريدة من نوعها ، بما في ذلك سهولة استهداف مناطق الدماغ الموزعة مكانيا ، فإن الحداثة الأساسية للمخطوطة الحالية هي وصف الزرع الجراحي واستراتيجيات التعافي بعد الجراحة ، والتي تسمح بإجراء دراسات مزمنة لنشاط الشبكة في الفئران اليافعة التي لا تزال في طور النمو. في الواقع ، يمكن تكييف منهجيات الجراحة والتعافي الموصوفة هنا لدعم عمليات الزرع الأخرى في الفئران اليافعة.
للحفاظ على تسجيل متسق عبر عدة أيام ، يجب تثبيت الأسلاك أو المجسات بشكل صارم على الجمجمة. في حين أن الهيكل العام لجمجمة الفأر يخضع لتغييرات طفيفة فقط بعد p20 ، فإن الجمجمة تتكاثف بشكل كبير بين الأعمار p20 و p4536. في الواقع ، الجمجمة في p20 ليست صلبة بما يكفي لدعم غرسة متصلة دون أن تتضرر. للتغلب على هذا القيد البيولوجي ، يقوم هذا البروتوكول بتكثيف الجمجمة بشكل مصطنع عبر cyanoacrylate أثناء جراحة الزرع. من المحتمل أن يكون الزرع في الفئران الأصغر من p20 ممكنا باستخدام هذه الإستراتيجية ، لكن جمجمة الفأر تخضع لتغييرات كبيرة في الحجم والشكل حتى p2036 تقريبا. وبالتالي ، لا ينصح بالزرع لفترات طويلة في الفئران الأصغر من p20 لأن cyanoacrylate ومسامير العظام الثابتة في الجمجمة التي لا تزال في طور النمو قد تؤثر بشكل كبير على النمو الطبيعي للجمجمة وتطور أنسجة المخ الأساسية. الأهم من ذلك ، في هذه الدراسة ، لم يلاحظ أي تأثير على القياسات الإجمالية للجمجمة أو حجم الدماغ بعد الزرع المزمن بدءا من p20 (الشكل 5C).
خطوة حاسمة في الطريقة الموصوفة في هذه المخطوطة هي استراتيجية التعافي بعد الجراحة. وفقا لهذه الاستراتيجية ، يجب موازنة وزن الغرسة باستمرار مع نضوج الفأر وخضوعه لتطوير الجهاز العضلي والعضلي الهيكلي. في وقت مبكر بعد الزرع ، لا تستطيع الفئران تحمل وزن الغرسة بنجاح دون موازنة ، مما يؤدي إلى سوء التغذية والجفاف حيث لا يستطيع الفأر الوصول بشكل كاف إلى مصادر الغذاء والماء في قفصه. نظام الموازنة سهل وغير مكلف في البناء ، وتافه في التنفيذ ، ويسمح للفئران من أي عمر قابل للزرع باستكشاف كامل قفصهم المنزلي بحرية ، وبالتالي ضمان التغذية الكافية والترطيب. مع تقدم الفئران في العمر ، يمكن تقليل كمية الموازنة حتى يمكن إزالتها بالكامل في الفئران البالغة. ومع ذلك ، يوصى بالاستخدام المستمر لنظام الموازنة طوال مدة التجربة مع ثقل موازن اسمي على الأقل متصل في جميع الأوقات. في حين أن الفأر البالغ قد يكون قادرا على تحمل حجم ووزن محرك الأقراص الصغير بمرور الوقت ، فإن الحركة الطبيعية المستمرة أثناء السلوك الحر دون تحسين ثقل موازن ينتج عزم الدوران وقوة القص على مسامير العظام التي تثبت محرك الأقراص الصغير على الجمجمة ، مما يجعلها عرضة بشكل متزايد للانفصال ، خاصة أثناء التجارب المزمنة الأطول.
هناك قيدان مهمان ملحوظان للدراسة الحالية. أولا ، لتقييم تأثير الزرع في p20 على نمو الجمجمة والدماغ ، تم التضحية بعدة مجموعات من الفئران بعد الزرع المطول (الشكل 5C). في حين أن هذه التحليلات لم تكشف عن أي تأثير كبير للزرع على حجم تجويف الجمجمة أو كتلة الدماغ (الشكل 5C) ، فإن الدراسة الحالية لم تفحص حجم الجمجمة أو كتلة الدماغ في نقاط زمنية متعددة طوال فترة النمو المبكرة ل p20-p60. بينما يوضح العمل السابق أن تطور تجويف الدماغ قد اكتمل بواسطة p2036 ، فمن الممكن أن يؤدي الزرع في هذه النافذة المبكرة إلى تغييرات غير متوقعة يتم تصحيحها أو تعويضها من خلال أعمار البالغين التي تم تقييمها هنا. ثانيا، لم تكن التجارب التي أنتجت بيانات الفيزيولوجيا الكهربية الموضحة في الشكلين 3 و4 مصممة لزيادة إنتاج الخلية إلى أقصى حد. وبالتالي ، في حين أن البيانات المقدمة هنا تظهر تسجيلات مستقرة ومزمنة ووحدات مفردة معزولة جيدا ، فلا ينبغي اعتبارها ممثلة للعائد المحتمل الأقصى لهذا الجهاز.
تظهر العديد من الاضطرابات العصبية والنفسية البشرية خلال فترات النمو المبكر أو عبر فترة المراهقة ، بما في ذلك التوحد والفصام. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الخلل الوظيفي على مستوى الدائرة الذي قد يكمن وراء هذه الأمراض ، على الرغم من وفرة نماذج الفئران المتاحة. يعد تحديد هذه التغييرات الأولية في الشبكة أمرا بالغ الأهمية لإنشاء استراتيجيات الكشف المبكر ونماذج العلاج. ومع ذلك ، بسبب التحديات التقنية ، لا يزال من غير الواضح كيف تتعطل وظيفة الشبكة عبر التطوير في نماذج الفئران للأمراض العصبية والنفسية. تم تصميم استراتيجية القيادة الصغيرة والتعافي الموصوفة هنا لدعم التحقيقات في تطوير شبكة الدماغ متعددة المناطق في دماغ الفأر ، وبالتالي السماح للباحثين بقياس نمو الدماغ الصحي وكذلك تحديد التغييرات في هذا التطور في نماذج الفئران للمرض.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 NS104829 (B.E.P.) ، R01 MH117149 (L.J.V.) ، و F99NS12053 (L.D.Q.) وجائزة UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. و L.D.Q.). يشكر المؤلفون جيني سكاريا (كلية الصيدلة بمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا) على المساعدة الفنية والدكتور بريندون واتسون (جامعة ميشيغان) على الاقتراحات المنهجية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved