تحسين نماذج ليبوفوسين والقياس الكمي لقدرة البلعمة في الجزء الخارجي في الثقافات الظهارية الصبغية للشبكية البشرية شديدة الاستقطاب

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج تراكم الليبوفوسين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية البشرية شديدة التمايز والاستقطاب (RPE) ومقايسة البلعمة المحسنة للجزء الخارجي (OS) للكشف عن إجمالي سعة استهلاك / تدهور نظام التشغيل ل RPE. تتغلب هذه الطرق على قيود نماذج ليبوفوسين السابقة ومقايسات البلعمة الكلاسيكية لمطاردة النبض.

Abstract

تساهم البلعمة اليومية للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية بواسطة ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في تراكم صبغة الشيخوخة داخل الخلايا التي تسمى ليبوفوسين. سمية ليبوفوسين راسخة في مرض ستارغاردت ، وهو تنكس الشبكية الوراثي الأكثر شيوعا ، ولكنه أكثر إثارة للجدل في الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في العالم المتقدم. كان تحديد سمية الليبوفوسين في البشر أمرا صعبا ، والنماذج الحيوانية ل Stargardt لها سمية محدودة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نماذج في المختبر تحاكي RPE البشري في الجسم الحي لفهم توليد الليبوفوسين وإزالته وسميته بشكل أفضل. كانت غالبية نماذج ليبوفوسين زراعة الخلايا حتى الآن في خطوط الخلايا أو تضمنت تغذية RPE بمكون واحد من خليط الليبوفوسين المعقد بدلا من شظايا / أطراف الجزء الخارجي للمستقبل الضوئي بأكمله ، مما يولد نموذجا أكثر اكتمالا وفسيولوجيا ليبوفوسين. الموصوف هنا هو طريقة للحث على تراكم المواد الشبيهة بالليبوفوسين (تسمى مادة التألق الذاتي غير القابلة للهضم ، أو UAM) في RPE البشري الأولي قبل الولادة (hfRPE) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من RPE. تراكمت UAM في الثقافات عن طريق التغذية المتكررة لشظايا OS المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية التي تمتصها RPE عن طريق البلعمة. كما تمت مناقشة الطرق الرئيسية التي يقترب بها UAM ويختلف عن lipofuscin في الجسم الحي . يرافق هذا النموذج من التراكم الشبيه بالليبوفوسين ، يتم تقديم طرق التصوير لتمييز طيف التألق الذاتي الواسع لحبيبات UAM من تلطيخ الأجسام المضادة المتزامن. أخيرا ، لتقييم تأثير UAM على قدرة البلعمة RPE ، تم تقديم طريقة جديدة لتحديد كمية امتصاص الجزء الخارجي / الأطراف وتفكيكها. تتغلب هذه الطريقة ، التي يطلق عليها "السعة الاستهلاكية الكلية" ، على التفسيرات الخاطئة المحتملة لقدرة البلعمة RPE المتأصلة في فحوصات "مطاردة النبض" الكلاسيكية للجزء الخارجي. يمكن استخدام النماذج والتقنيات المقدمة هنا لدراسة توليد الليبوفوسين ومسارات الإزالة والسمية المفترضة.

Introduction

توفر ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) دعما حاسما للمستقبلات الضوئية العلوية ، بما في ذلك الامتصاص اليومي وتدهور أطراف أو شظايا الجزء الخارجي للمستقبلات الضوئية (خلال هذا البروتوكول ، يشير اختصار OS إلى نصائح أو شظايا نظام التشغيل بدلا من الأجزاء الخارجية بأكملها). هذا الامتصاص اليومي في RPE بعد الانقسام يؤدي في النهاية إلى زيادة التحميل على قدرة البلعمة ويؤدي إلى تراكم مادة غير قابلة للهضم ، ذاتية الفلورسنت داخل الخلايا ، تسمى ليبوفوسين. ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من الدراسات أظهرت أيضا أن RPE lipofuscin يمكن أن يتراكم بدون البلعمة^{OS 1,2}. يحتوي Lipofuscin على العديد من المكونات ، بما في ذلك المضافات المتشابكة ....

Protocol

تمت مراجعة البروتوكول الحالي الذي يتضمن اقتناء واستخدام الأنسجة البشرية والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ميشيغان (HUM00105486).

1. إعداد نصائح وشظايا الجزء الخارجي المؤكسد بالصور

ملاحظة: تم شراء شبكية العين البقري المتكيفة مع الظلام وشحنها على الجليد (انظر جدول المواد). من شبكية العين هذه ، تم تنقية نظام التشغيل باتباع بروتوكول²³ المنشور مسبقا.

1. ربط متقاطع للجزء الخارجي مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية
   1. اغمر الشرائح المطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين (انظر جدول المواد) تماما في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق في خزانة السلامة ا....

النتائج

يوضح الشكل 1Ai إعداد الأكسدة الضوئية لنظام التشغيل. تسمح الشرائح المطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين بتحميل حجم كبير من نظام التشغيل في المحلول لكل مستطيل مفتوح دون الانتشار عبر بقية الشريحة. يتم احتواء الشريحة مع نظام التشغيل داخل طبق بتري معقم مع الغطاء ، ويتم وضع مصباح ال?.......

Discussion

بينما تمت دراسة RPE lipofuscin لعقود من الزمن ، فإن سميته تناقش²،⁹،^16،42. بالنظر إلى الغموض حول سمية الليبوفوسين من النماذج الحيوانية¹¹ ، فإن النماذج في المختبر التي تستخدم RPE البشري قيمة. تم وصف مجموعة من نماذج .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000