JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Zusammenfassung

Die tägliche Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente durch das retinale Pigmentepithel (RPE) trägt zur Akkumulation eines intrazellulären Alterungspigments bei, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Die Toxizität von Lipofuszin ist bei Morbus Stargardt, der häufigsten erblichen Netzhautdegeneration, gut belegt, ist aber bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, umstrittener. Die Bestimmung der Lipofuszin-Toxizität beim Menschen war schwierig, und Tiermodelle von Stargardt weisen eine begrenzte Toxizität auf. Daher werden In-vitro-Modelle benötigt, die humanes RPE in vivo nachahmen, um die Bildung, Clearance und Toxizität von Lipofuszin besser zu verstehen. Die meisten bisherigen Liofuszin-Modelle in Zellkulturen wurden in Zelllinien oder mit einer einzigen Komponente der komplexen Lipofuszinmischung gefüttert, anstatt mit Fragmenten/Spitzen des gesamten äußeren Segments des Photorezeptors, wodurch ein vollständigeres und physiologischeres Lipofuszin-Modell entsteht. Hier wird eine Methode beschrieben, um die Akkumulation von Lipofuscin-ähnlichem Material (unverdauliches Autofluoreszenzmaterial oder UAM) in hochdifferenzierten primären humanen pränatalen RPE (hfRPE) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten RPE zu induzieren. UAM, akkumuliert in Kulturen durch wiederholte Fütterung von mit ultraviolettem Licht behandelten OS-Fragmenten, die vom RPE über Phagozytose aufgenommen wurden. Die wichtigsten Möglichkeiten, wie sich UAM in vivo Lipofuszin annähert und von diesem unterscheidet, werden ebenfalls diskutiert. Begleitend zu diesem Modell der Lipofuscin-ähnlichen Akkumulation werden bildgebende Verfahren zur Unterscheidung des breiten Autofluoreszenzspektrums von UAM-Granula von gleichzeitiger Antikörperfärbung vorgestellt. Um den Einfluss von UAM auf die RPE-Phagozytosekapazität zu bewerten, wurde schließlich eine neue Methode zur Quantifizierung der Aufnahme und des Abbaus von Fragmenten/Spitzen des äußeren Segments eingeführt. Diese Methode, die als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet wird, überwindet mögliche Fehlinterpretationen der RPE-Phagozytose-Kapazität, die klassischen "Pulse-Chase"-Assays im äußeren Segment innewohnen. Die hier vorgestellten Modelle und Techniken können verwendet werden, um die Entwicklung und Clearance von Lipofuszinen sowie die mutmaßliche Toxizität zu untersuchen.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) bietet eine wichtige Unterstützung für die darüber liegenden Photorezeptoren, einschließlich der täglichen Aufnahme und des Abbaus von Photorezeptorspitzen oder -fragmenten (in diesem Protokoll steht die Abkürzung OS eher für OS-Spitzen oder -Fragmente als für ganze äußere Segmente). Diese tägliche Aufnahme des postmitotischen RPE überlastet schließlich die phagolysosomale Kapazität und führt zur Ansammlung von unverdaulichem, autofluoreszierendem intrazellulärem Material, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Interessanterweise haben mehrere Studien auch gezeigt, dass RPE-Lipofuszin auch ohne OS-Phagozytose akkumulieren kann 1,2. Lipofuszin besteht aus vielen Komponenten, einschließlich vernetzter Addukte, die von Retinoiden des visuellen Zyklus abgeleitet sind, und kann bei Personen über 80 Jahren fast 20 % des RPE-Zellvolumens einnehmen3.

Ob Lipofuszin toxisch ist, wurde heiß diskutiert. Morbus Stargardt ist eine autosomal-rezessive Degeneration der Photorezeptoren und des RPE, bei der eine Mutation in ABCA4 eine fehlerhafte Verarbeitung von Retinoiden des visuellen Zyklus auslöst, die in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren enthalten sind. Eine unsachgemäße Verarbeitung von Retinoiden führt zu einer fehlerhaften Vernetzung und Bildung von Bis-Retinoid-Spezies, einschließlich des Bis-Retinoid-N-Retinyliden-N-Retinylethanolamins (A2E). Studien haben mehrere Mechanismen für die A2E-Toxizität gezeigt 4,5. Lipofuszin trägt zu den Autofluoreszenzsignalen des Fundus während der klinischen Bildgebung bei, und sowohl Stargardts Patienten als auch Tiermodelle zeigen eine erhöhte Fundus-Autofluoreszenz vor der Netzhautdegeneration, was auf eine Korrelation zwischen Lipofuszinspiegeln und Toxizität hindeutet 6,7. Mit zunehmendem Alter reichert sich Lipofuszin jedoch bei allen Menschen an, ohne eine RPE-Degeneration auszulösen. Darüber hinaus haben bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), bei der die RPE-Degeneration nur bei älteren Patienten auftritt, diejenigen mit frühen und intermediären Formen der Krankheit weniger Fundus-Autofluoreszenzsignale als altersgleiche nicht erkrankte Menschen8. Diese klinischen Befunde wurden auch auf histologischer Ebene verifiziert 9,10.

Tiermodelle zur Akkumulation von RPE-Lipofuszin haben auch einige Unklarheiten über die Toxizität von Lipofuszin hinterlassen. Die ABCA4-Knockout-Maus zeigt auf einem pigmentierten Untergrund keine Netzhautdegeneration, während dies auf einem Albino-Hintergrund oder bei blauem Licht der Fall ist11,12. Darüber hinaus unterscheidet sich die Toxizität von Lipofuszin, das durch ABCA4-Knockout abgeleitet wird, wahrscheinlich von dem langsamer akkumulierenden Lipofuszin, das bei natürlicher Alterung auftritt, wie es bei AMD13 zu beobachten ist.

In-vitro-Modelle der Lipofuszin-Akkumulation bieten eine Alternative zur Untersuchung der Auswirkungen der Lipofuszin-Akkumulation auf die RPE-Gesundheit. Solche Modelle ermöglichen die Manipulation von Lipofuszin-Komponenten, von der Fütterung einzelner Retinoid-Komponenten bis hin zur Fütterung von OS, und ermöglichen die Untersuchung von RPE beim Menschen statt beim Tier. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Methoden entwickelt, um RPE-Lipofuszin in Kultur zu modellieren. Zusammen mit anderen Gruppen fütterte die Gruppe von Dr. Boulton bis zu drei Monate lang täglich Rinder-OS mit menschlichen primären RPE-Zellen von Spendern im Alter von 4 bis 85 Jahren14. Alternativ hat die Hemmung der Autophagie auch zu einer Akkumulation von Lipofuszin in den Passagen 3 bis 7 primärer humaner RPE-Kulturen geführt15. Die subletale lysosomale Hemmung in hochdifferenzierten, primären humanen pränatalen RPE-Kulturen (hfRPE) der Passage 1 konnte jedoch selbst bei wiederholter täglicher Zugabe von OS kein Lipofuscin induzieren16.

Als reduktionistischeren Ansatz haben andere Kulturen mit einzelnen Lipofuszin-Komponenten gefüttert, insbesondere mit dem Bis-Retinoid A2E 4,17. Solche Studien sind insofern wertvoll, als sie mögliche direkte Toxizitätsmechanismen für einzelne Lipofuszin-Komponenten definieren, die beispielsweise lysosomales Cholesterin und Ceramid-Homöostase beinhalten18. Gleichzeitig wird die Toxizität von A2E19 diskutiert, und die direkte Verfütterung an Zellen umgeht den typischen Weg der Lipofuszin-Akkumulation, der die Phagozytose des Photorezeptor-OS beinhaltet. In dem Versuch, alle Bestandteile von Lipofuszin in RPE-Kulturen zu bringen, reinigten Boulton und Marshall Lipofuszin aus dem menschlichen Auge und fütterten es an die Passage 4 bis 7 menschlicher primärer RPE-Kulturen, die sowohl von fötalen als auch von älteren menschlichen Spendern stammten20. Obwohl diese Methode innovativ ist, stellt sie eine begrenzte Lipofuszinquelle für wiederholte Experimente dar.

Während wiederholte Fütterungen von OS an RPE-Kulturen in vielen Systemen Lipofuszin produzieren, ist dies in hochdifferenzierten primären RPE-Kulturen nicht der Fall16. Photooxidierendes OS induziert Vernetzungsreaktionen wie die Bildung von Bis-Retinoiden, die auf natürliche Weise während der Lipofuszin-Bildung in vivo auftreten. Dies kann die Bildung von Lipofuscin-ähnlichen Granula in RPE-Kultursystemen beschleunigen, selbst in solchen, die hochdifferenziert und resistent gegen die Akkumulation von Lipofuszin sind16. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Induktion von Lipofuscin-ähnlicher Granulaakkumulation in hochdifferenziertem hfRPE und humanem iPSC-RPE vorgestellt, modifiziert von Wihlmarks veröffentlichtem Protokoll21. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie Lipofuscin-ähnliche Granula induziert, die die gleiche Quelle (Photorezeptor-OS) und den gleichen Signalweg (phagolysosomale OS-Aufnahme) verwenden, wie es bei der Lipofuszinogenese in vivo der Fall ist. Darüber hinaus wird es an humanen RPE-Kulturen durchgeführt, die hochdifferenziert und in mehreren Studien validiert wurden, um humanes RPE in vivo zu replizieren 22,23,24. Diese Lipofuscin-ähnlichen Granulate werden als unverdauliches autofluoreszierendes Material (UAM) bezeichnet und liefern Daten und Diskussionen in diesem Protokoll, in dem UAM mit In-vivo-Lipofuscin verglichen wird. Neben Methoden zum Aufbau und zur Evaluierung von UAM-beladenen Kulturen in hochdifferenzierten humanen RPE wird auch eine aktualisierte Methode zur Beurteilung der RPE-OS-Phagozytose vorgestellt. Es wurden mehrere hervorragende Pulse-Chase-Methoden zur Quantifizierung der OS-Phagozytose eingeführt, darunter Western Blotting, Immunzytochemie und FACS25,26,27. Zu Beginn der Pulsjagd des Betriebssystems können jedoch Bedingungen, die zu einer schlechten Aufnahme des Betriebssystems führen, mit Bedingungen verwechselt werden, die einen schnellen Abbau des internalisierten Betriebssystems fördern. Die hier vorgestellte Methode misst die Gesamtmenge des eingeführten Betriebssystems, die vollständig durch die RPE ("Total Consumptive Capacity") verbraucht/abgebaut wird, und trägt so dazu bei, diese Mehrdeutigkeit zu beseitigen. Es wird erwartet, dass Erkenntnisse über die Toxizität von Lipofuszin unter Verwendung dieser Protokolle, einschließlich der Auswirkungen auf die OS-Phagozytoseraten unter Verwendung der "Total Consumptive Capacity"-Methode, verwendet werden, um die Toxizität von Lipofuszin in vivo zu beleuchten.

Protokoll

Das vorliegende Protokoll, das den Erwerb und die Verwendung von menschlichem Gewebe vorsieht, wurde vom Institutional Review Board der University of Michigan geprüft und genehmigt (HUM00105486).

1. Präparation von photooxidierten äußeren Segmentspitzen und -fragmenten

HINWEIS: Die an Dunkelheit angepasste Rindernetzhaut wurde gekauft und auf Eis versandt (siehe Materialtabelle). Von diesen Netzhäuten wurden die OS nach einem zuvor veröffentlichten Protokollgereinigt 23.

  1. Vernetzung des äußeren Segments mit einer UV-Lampe
    1. Tauchen Sie die mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger (siehe Materialtabelle) 10 Minuten lang vollständig in 70%iges Ethanol in einer Biosicherheitswerkbank ein, um die Objektträger zu sterilisieren. Lassen Sie die Objektträger in einer sterilen 100-mm-Zellkulturschale an der Luft trocknen.
    2. Legen Sie jeden Objektträger in eine neue 100-mm-Zellkulturschale und geben Sie 200 μl serumhaltige Zellkulturmedien (welches Medium auch immer typischerweise für die vorliegenden RPE-Kulturen verwendet wird) in jedes Rechteck und legen Sie dann ein tragbares 254-nm-UV-Licht (siehe Materialtabelle) auf die 100-mm-Zellkulturschale (ohne Deckel) mit dem Kolben direkt zum Objektträger. und 20 Minuten einwirken lassen. Die für diese Studie konkret verwendeten Medien und die spezifischen Produktnummern für die Bestandteile des Mediums wurden bereits veröffentlicht 22,23. Dieses Medium wird in diesem Protokoll als "RPE-Medien" bezeichnet.
      Anmerkungen: Die UV-Behandlung des Mediums blockiert die Glasoberfläche und verhindert, dass das OS bei den nächsten Schritten klebt.
    3. Gefrorene Aliquots von OS bei 37 °C auftauen (in der Hand oder im Wasserbad). Die Menge des benötigten Betriebssystems hängt von der Anwendung ab. Im Allgemeinen kann man bis zu 500 μL von 2 x 108 OS/mL pro Rechteck auf dem Objektträger behandeln.
    4. Nach dem Auftauen das OS bei 2400 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur schleudern. Saugen Sie den Überstand in der Biosicherheitswerkbank sofort mit einer Pipette statt mit einem Vakuum ab, um einen versehentlichen Verlust des Pellets zu vermeiden.
    5. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit sterilem PBS.
      Anmerkungen: Behalten Sie das Volumen und die erwartete Konzentration im Auge. Wenn Sie z. B. das Pellet aus einem 1-ml-Röhrchen mit 1 x 108 OS/ml mit 500 μl PBS resuspendieren, erhalten Sie 2 x 108 OS/ml. Das maximale Volumen und die maximale Konzentration pro Rechteck auf dem mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger beträgt 500 μl von 2 x 108 OS/ml.
    6. Saugen Sie das Medium von den Objektträgern ab und geben Sie bis zu 500 μl 2 x 108 OS/ml PBS-Lösung auf jedes Rechteck des Objektträgers. Platzieren Sie das tragbare UV-Licht über der Zellkulturschale (ohne Deckel), wobei die Glühbirne direkt zum Betriebssystem zeigt. Setzen Sie die OS-Lösung 40 Minuten lang 254 nm Licht aus.
      Anmerkungen: Decken Sie während der 40-minütigen Exposition die UV-Lampe und die Schüssel mit einem Handtuch oder einem saugfähigen Pad ab, schließen Sie den Flügel der Biosicherheitswerkstatt und schalten Sie das Gebläse aus. Dadurch wird verhindert, dass eine nennenswerte Verdunstung auftritt. Wenn die in diesem Protokoll verwendete UV-Lampe einem Forscher nicht zur Verfügung steht, gibt es zwei Alternativen, um sicherzustellen, dass die angemessene Menge an Vernetzung erreicht wird. Die erste besteht darin, die in Schritt 1.2 beschriebene quantitative UV-Exposition entweder mit der in Schritt 1.2 beschriebenen Vorrichtung oder mit einer anderen Vorrichtung zu befolgen, die die gleiche quantitative Strahlungsexposition wie die in 1.2 beschriebene Vorrichtung liefern kann. Eine andere Alternative besteht darin, das OS für eine gewisse Zeit UV-Bestrahlung auszusetzen, die den Grad der Vernetzung auf der Coomassie-Färbung induziert, der in Abbildung 1C zu sehen ist.
    7. Sammeln Sie die behandelte OS PBS-Lösung in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen, waschen Sie das Rechteck des beschichteten Objektträgers erneut mit 200-500 μl PBS (2-3x) und sammeln Sie jede Wäsche im Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn Sie fertig sind, schauen Sie sich den Objektträger unter einem Gewebekulturraummikroskop an, um sicherzustellen, dass fast das gesamte OS aus dem Objektträger entfernt wurde.
    8. Drehen Sie die OS PBS-Lösung bei 2400 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur herunter, saugen Sie das PBS in der Biosicherheitswerkbank mit einer Pipette ab und resuspendieren Sie es in 500-μl-Standardmedien, die für RPE-Kulturen verwendet werden (z. B. "RPE-Medien" im Sinne von Abschnitt 1.1.2). Das Resuspensionsvolumen kann basierend auf der gewünschten Konzentration des photooxidierten OS (OxOS) eingestellt werden.
    9. Geben Sie 10 μl der Suspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, verdünnen Sie 50-100x mit mehr Zellkulturmedien und zählen Sie die OS mit einem Hämozytometer.
    10. Basierend auf der Anzahl der Gesamtüberlebenden ist die OxOS-Suspension auf eine endgültige Bestandskonzentration zu verdünnen. Für die Fütterung hochreifer RPE-Kulturen in 24-Well-Transwells (Oberfläche von 0,33cm2; siehe Materialtabelle) wird eine Endmedienkonzentration von 2 x 107 OS/ml empfohlen.
      1. Um dies zu erreichen, verteilen Sie das OxOS in 25-μl-Aliquots mit einer Konzentration von 5,6 x 107 OS/ml, die in Standard-RPE-Nährmedien suspendiert sind. Nach dem Auftauen eines 25-μl-Aliquots wird das gesamte Aliquot mit 45 μl Standard-RPE-Nährmedien gemischt, wobei ein endgültiges Medienvolumen von 70 μl und eine OS-Konzentration von 2 x 107 OS/ml für jede OxOS-Transwell-Fütterung erreicht wird.
    11. Vor der Aliquotierung des OxOS werden phagozytoseüberbrückende Liganden (Protein S und MFG-E8, siehe Materialtabelle) hinzugefügt, die die Aufnahme des OS und die Akkumulation von Lipofuszin erleichtern. Die Arbeitskonzentrationen der verbrückenden Liganden in einem 24-Well-Transwell betragen 4 μg/ml für humanes gereinigtes Protein S und 1,5 μg/ml für humanes rekombinantes MFG-E8. So beträgt für 25 μL Aliquots von OxOS bei 5,6 x 107 OS/ml die Stammkonzentration für Protein S 11,2 μg/ml und für MFG-E8 4,2 μg/ml.
      HINWEIS: Die Brückenligandenkonzentrationen wurden für hfRPE-Kulturen auf 24-Well-Transwells optimiert, mit einer ungefähren Zellzahl von 320.000 Zellen pro 0,33cm2-Well . Möglicherweise müssen die Ligandenkonzentrationen für andere RPE-Typen und Zelldichten angepasst werden, da Liganden, die über die Verfügbarkeit von Phagozytoserezeptoren hinausgehen, paradoxerweise die Aufnahme des OS blockieren können28.
    12. Die Aliquots in flüssigem Stickstoff einfrieren.
      HINWEIS: Mehrfaches Einfrieren und Auftauen wirkt sich sehr nachteilig auf die Integrität des Betriebssystems aus.
  2. Außensegmentvernetzung mit einem UV-Vernetzer
    HINWEIS: Befolgen Sie Schritt 1.1, mit Ausnahme der folgenden Schritte, die die Schritte 1.1.2 bzw. 1.1.6 ersetzen:
    1. (ersetzt Schritt 1.1.2) Legen Sie jeden Objektträger in eine neue 100-mm-Zellkulturschale und geben Sie 200 μl serumhaltige Zellkulturmedien (z. B. -"RPE-Medien" oder einen anderen Ersatz) in jedes Rechteck, legen Sie dann die Objektträger in ein Ultraviolett-Vernetzergerät (siehe Materialtabelle) und behandeln Sie sie mit 254 nm UV bei einer Strahlungsexposition von 3-6 J/cm2 , um die Glasoberfläche zu blockieren und ein Anhaften des OS während der nächsten Schritte zu verhindern.
    2. (ersetzt Schritt 1.1.6) Saugen Sie das Medium von den Objektträgern ab und geben Sie bis zu 500 μl 2 x 108 OS/ml in sterilem PBS auf jedes Rechteck des Objektträgers. Legen Sie die Objektträger in den UV-Vernetzer, stellen Sie die Strahlungsbelichtung nach Bedarf ein (3-9 J/cm2) und behandeln Sie sie bei 254 nm.
      HINWEIS: Die erforderliche Strahlungsexposition kann sorgfältig bestimmt werden, indem die Strahlungsexposition zwischen 3-9 J/cm2 titriert wird, bis der Grad der Autofluoreszenz und der Proteinvernetzung (wie in Abbildung 1B und Abbildung 1C zu sehen) erreicht ist.
      VORSICHT: Der Umgang mit dem Betriebssystem außerhalb einer Biosicherheitswerkbank kann zu einer Kontamination führen. Nachdem Sie das OS dem UV-Vernetzer ausgesetzt haben, sammeln Sie das OS mit sterilen Pipettenspitzen, überführen Sie es in sterile Mikrozentrifugenröhrchen und führen Sie alle weiteren Schritte in der Biosicherheitshaube durch.
  3. Charakterisierung von oxidiertem OS
    1. Quantifizierung des Autofluoreszenz-Emissionsspektrums durch Bildgebung
      1. Geben Sie 20-50 μl Stammlösung aus unbehandeltem OS und OxOS in zwei separate Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 2400 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, Pellet in gepuffertem (z. B. PBS) 4%igem Paraformaldehyd resuspendieren und 15 min bei Raumtemperatur fixieren.
      2. Nach der Fixierung wie oben beschrieben, mit 2 x PBS waschen (zwischen den Wäschen nach unten schleudern) und dann in weniger als 30 μl PBS resuspendieren.
      3. Geben Sie einige Mikroliter der Resuspension auf einen Objektträger, fügen Sie Eindeckmedien (siehe Materialtabelle) und schließlich ein Deckglas hinzu.
      4. Abbildung von OxOS auf einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle).
        HINWEIS: Die OxOS-Autofluoreszenz kann durch einen breiten Bereich von Laserwellenlängen angeregt werden, aber in der Regel wird eine 405-nm- oder 488-nm-Laserlinie verwendet. Die Emission ist ähnlich breit gefächert, aber ein typischer GFP/FITC-Anregungs-/Emissionsfilteraufbau ist ausreichend, um Autofluoreszenz zu betrachten.
      5. Um das OxOS-Emissionsspektrum zu messen, verwenden Sie λ-Scanning an einem konfokalen Mikroskop. Typische λ-Scan-Einstellungen umfassen die Anregung mit 405 nm oder 488 nm und die Detektion von Emissionen, die von 10 nm rotverschoben von der Laseranregungslinie bis zu etwa 800 nm reichen, mit einer λ-Schrittweite von 10 nm. Jedes Mikroskopiesystem hat seine eigenen Anweisungen, wie der λ-Modus zu verwenden ist, und der Leser muss sich auf das Handbuch beziehen, um sein spezifisches Konfokalsystem zu finden.
    2. Alternativ kann die Autofluoreszenz mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden.
      1. 2 x 10 7 unbehandelte OS und separat 2 x 107 OxOS in Mikrozentrifugenröhrchen abschleudern und in 1 ml PBS resuspendieren.
        Anmerkungen: Eine Fixierung ist nicht erforderlich, wenn die Durchflusszytometrie direkt nach dem Auftauen durchgeführt wird.
      2. Laden Sie unbehandelte OS- und OxOS-Proben auf das Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) im FSC-SSC-Streudiagramm auf eine akzeptable Streuung an. Verwenden Sie PBS als Kontrolle, um kontaminierende kleine Partikel auszuschließen. Beachten Sie, dass Betriebssysteme erheblich kleiner als Zellen sind.
      3. Verwenden Sie den Standard-FITC-Kanal des Durchflusszytometers für die Autofluoreszenzquantifizierung. Zählen Sie mindestens 10.000 Ereignisse. Verwenden Sie den Pulsflächenwert des FITC-Histogramms, um die Fluoreszenzintensität darzustellen.
        HINWEIS: Für die vorliegende Studie werden alle Daten mit einer Durchflusszytometer-Analysesoftware (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.
    3. Beurteilen Sie den Grad der Vernetzung in OxOS
      1. Schleudern Sie 2 x 10 7 unbehandelte OS und separat 2 x 107 OxOS in Mikrozentrifugenröhrchen ab. Entfernen Sie den Überstand und lysieren Sie das Pellet direkt, indem Sie 1,2x Laemmli-Probenpuffer hinzufügen (genug, um es abzudecken; siehe Materialtabelle). Vortex, 30 min bei Raumtemperatur halten, 10 min bei Raumtemperatur gleich oder größer als 12000 x g herunterdrehen und Überstand auffangen.
        HINWEIS: Die Beurteilung des Grades der Proteinvernetzung in OxOS gibt einen Eindruck von der Angemessenheit der UV-Behandlung. Es wird ein Vergleich zwischen unbehandeltem OS und OxOS durchgeführt, und eine adäquate Vernetzung tritt auf, wenn die monomere Rhodopsinbande, die die Coomassie-Färbung dominiert (Abbildung 1C, Pfeil), gerade noch wahrnehmbar ist, wobei Aggregate höherer Ordnung und ein Proteinabstrich an der Oberseite des Gels entstehen.
        VORSICHT: Wenn Sie den Probenpuffer zum Lysieren des OS verwenden, erhitzen Sie die Lyselösung anschließend nicht, da dies eine Rhodopsin-Aggregation auslösen kann. Vermeiden Sie es auch, das lysierte Betriebssystem zu kühlen, bis es für die Lagerung bereit ist, da dies SDS auslöst. Nicht verwendete Lysate können bei -20 °C aufbewahrt werden. Achten Sie beim Wiederauftauen darauf, dass die Lysate vor der Verwendung vollständig bei Raumtemperatur aufgetaut sind.
      2. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit einem Proteinassay, der gegenüber hohen SDS- und Reduktionsmittelkonzentrationen tolerant ist29. In der Materialtabelle finden Sie Vorschläge zu geeigneten Proteinassay-Reagenzien, und befolgen Sie das Herstellerprotokoll für diese Reagenzien.
      3. Führen Sie unbehandelte OS- und OxOS-Proben durch SDS-PAGE-Elektrophorese30 auf einem 4%-15%igen Gradientengel unter Verwendung von Standard-Tris-Glycin-SDS-Puffer durch. Das Gel wird bei 80 V betrieben, bis die Proben in den Stapel gelangen, dann bei 120 V für 50-60 Minuten bei Raumtemperatur.
      4. Färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau unter Verwendung der Standardprotokolle31. Die Coomassie-Färbung wird die Angemessenheit der durch die UV-Behandlung induzierten Vernetzung demonstrieren.

2. Aufbau von Lipofuscin-ähnlichen Granula (UAM) in RPE-Kulturen

  1. OxOS-Fütterungen: Menge, Häufigkeit und Phagozytose-überbrückende Liganden
    HINWEIS: Die Fütterung erfolgt an humanen iPSC-RPE- oder hfRPE-Kulturen an Passage 1, die nach dem vom Bharti-Labor (für iPSC-RPE)32 beschriebenen Protokoll oder unserem zuvor skizzierten Protokoll für hfRPE, adaptiert aus dem Sheldon Miller-Labor22, 23, gezüchtet wurden. Alle folgenden Berechnungen basieren auf der Fütterung von OxOS oder OS in ein 24-Well-Transwell (6,5 mm Durchmesser, 0,33cm2 Wachstumsfläche).
    1. Tauen Sie 25 μl von 5,6 x 107 OxOS/ml bei 37 °C auf und fügen Sie dem OxOS-Aliquot 45 μl Zellkulturmedien hinzu, was zu einem Endvolumen von 70 μl führt.
      HINWEIS: Die in Schritt 1 hergestellten OxOS-Aliquots enthalten die Phagozytose-überbrückenden Liganden MFG-E8 und Protein S. Wenn diese Liganden jedoch vor dem Einfrieren nicht zu den Aliquoten hinzugefügt wurden, können sie in diesem Schritt hinzugefügt werden, wodurch sichergestellt wird, dass die Endkonzentration der Liganden in den Medien, die den Zellen zugeführt werden sollen, 4 μg/ml für Protein S und 1,5 μg/ml für MFG-E8 beträgt. Wie in Schritt 1.1.11 beschrieben, müssen die Konzentrationen von Brückenliganden möglicherweise für andere RPE-Typen oder Zelldichten geändert werden.
    2. Entfernen Sie apikales Medium aus dem Transwell und geben Sie 70 μl 2 x 107 OxOS/ml mit den phagozytoseüberbrückenden Liganden in die apikale Kammer. Nach 24 Stunden entfernen und durch eine neue OxOS-Fütterung ersetzen. Die Fütterung erfolgt täglich an Wochentagen und überspringt Wochenenden, bis 20 Fütterungen abgeschlossen sind (~1 Monat). Wechseln Sie basolaterale Zellkulturmedien (400-550 μL) 2-3x/Woche.
    3. Nach Abschluss von 20 Fütterungen ist der normale Medienwechsel für das Bohrloch wieder aufzunehmen.
      HINWEIS: Es sind mehrere zusätzliche Medienwechsel erforderlich, um klebriges OxOS von der apikalen RPE-Oberfläche abzuwaschen, daher müssen Experimente mit den UAM-beladenen Kulturen mindestens 1-2 Wochen nach Abschluss der OxOS-Fütterung durchgeführt werden.
      ACHTUNG: Es ist wichtig, dass der UAM-Aufbau über OxOS-Feedings ordnungsgemäß kontrolliert wird. Da tägliche Medienwechsel die RPE-Biologie beeinflussen können, werden die folgenden Kontrollvertiefungen empfohlen: Kontrolle 1: Ersetzen Sie die Medien täglich an Wochentagen für die gleiche Anzahl von Fütterungen wie die mit OxOS behandelte Gruppe. Kontrolle 2: Füttern Sie RPE unbehandeltes OS täglich an Wochentagen in der gleichen Konzentration und Menge wie OxOS-Fütterungen für die gleiche Anzahl von Fütterungen.
  2. Überwachung der Gesundheit von Kulturen, die mit Lipofuscin-ähnlichen Granula beladen sind, durch transepitheliale elektrische Widerstands- (TEER) und Zelltod-Assays
    HINWEIS: Während und nach der OxOS-Fütterung kann die Gesundheit von RPE-Kulturen gemessen werden, indem die Integrität der RPE-Tight Junctions und der Zelltod bewertet werden. Es wurde bereits gezeigt, dass die Beurteilung der Tight Junction-Integrität durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) ein empfindlicher Marker für die allgemeine Zellgesundheit ist33. Traditionellere nicht-invasive Marker für den Zelltod, wie z. B. die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH), können ebenfalls verwendet werden.
    1. TEER durchführen
      HINWEIS: TEER wird mit einem TEER-Messgerät (Trans epithelial Electric Resistance) und einer TEER-Elektrode getestet, wobei in der Regel den Anweisungen des Herstellers gefolgt wird (siehe Materialtabelle).
      1. Um die TEER-Elektrode zu sterilisieren, verwenden Sie einen in 70 % Ethanol getränkten Abstreifer, um die Elektrode zu reinigen, und tauchen Sie dann die Spitzen der Elektrodensonde 10 Minuten lang in 70 % Ethanol ein.
      2. Lassen Sie die Elektrode vollständig trocknen und tauchen Sie die Elektrode dann in sterile Medien.
      3. Entfernen Sie die Sonde aus dem sterilen Medium und führen Sie die beiden Sonden der TEER-Elektrode in die apikalen und basolateralen Kammern eines kultivierten Transwells ein. Die längere Sondenspitze passt in die basolaterale Kammer.
        HINWEIS: Es ist einfach, den Boden der apikalen Kammer mit der TEER-Elektrode ohne Übung abzukratzen, und ein solches Schaben verändert die TEER-Messwerte dramatisch, wenn die konfluente RPE-Monoschicht gestört wird. Daher wird Anfängern empfohlen, vor dem Testen an experimentellen RPE-Kulturen an unwichtigen Transwells zu üben. Des Weiteren sollte der Experimentator, nachdem jede Platte mit RPE-Kulturen getestet wurde, unter einem Standard-Gewebekulturmikroskop prüfen, ob die RPE-Monoschicht abgekratzt wurde.
      4. Sobald die apikalen und basolateralen Sonden im Transwell angebracht sind, drücken Sie die Lesetaste oder treten Sie auf den Fußschalter des Messgeräts, um den TEER aufzuzeichnen. Waschen Sie die Elektrodensonde zwischen Platten oder Zellgruppen mit sterilen Medien. Wenn eine Infektion ein großes Problem darstellt, sterilisieren Sie es zwischen den Platten erneut.
      5. Berechnen Sie TEER, indem Sie den Widerstandswert vom Messgerät nehmen, den Wert eines leeren Transwells mit Medien, aber ohne Zellen subtrahieren (im Allgemeinen 100-110 Ω für ein 24-Well-Transwell mit einer Oberfläche von 0,33cm2 ) und dann mit der Oberfläche des Transwell multiplizieren.
        HINWEIS: TEER-Werte müssen normalisiert auf die Zelloberfläche gemeldet werden. Typische Werte für gesunde hfRPE-Kulturen liegen zwischen 350 und 1100 Ωcm2. Die TEER-Werte steigen mit sinkender Temperatur. Wenn also Kulturen aus einem 37 °C-Inkubator in eine Raumtemperaturhaube gebracht werden, steigen die TEER-Werte tendenziell über die gesamte Platte an. Um sich vor dieser Variabilität zu schützen, arbeiten Sie entweder schnell (falls vorhanden) oder warten Sie 10-15 Minuten, bis sich die Plattentemperatur mit der Raumtemperatur eingependelt hat.
    2. Führen Sie einen LDH-Freisetzungstest durch
      HINWEIS: Die Freisetzung von LDH in den Zellkulturüberstand erfolgt während des Zelltods und wird mit einem Standardkit gemessen (siehe Materialtabelle).
      1. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird der Überstand oberhalb der Zellen entnommen und mit Standardmedien auf 1:100 verdünnt.
      2. Induzieren Sie die mögliche Gesamtfreisetzung von LDH, die für die Normalisierung aller Werte aus Schritt 2.2.2.1 wichtig ist, durch Zugabe von 2 μL 10% Triton X-100 zu den 100 μL apikalen Medien aus Kontrollzellen in einem 24-Well-Transwell. Nachdem das Triton/Zell-Überstandsgemisch 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurde, mischen Sie das Medium über den nun lysierten Zellen und sammeln Sie, um die mögliche Gesamtfreisetzung von LDH zu messen.
      3. Sobald die Überstände gesammelt wurden, führen Sie den Assay gemäß den Standardanweisungen des Herstellers durch und messen Sie die Lumineszenz nach einer 30-minütigen Inkubation mit der Pufferlösung des Kits.
        HINWEIS: Alle LDH-Werte sind auf die mögliche Gesamtmenge der LDH-Freisetzung normalisiert.
  3. Charakterisierung des lipofuscinartigen Granulaspektrums und der Zusammensetzung
    1. Erfassung von Autofluoreszenzquantifizierung und -spektren
      1. Fixieren Sie UAM-beladene Kulturen mit 4% PFA bei Raumtemperatur für 15 Minuten, gefolgt von einer PBS-Wäsche 5x.
      2. Bewahren Sie eine kleine Menge PBS in der apikalen Kammer auf und drehen Sie das Transwell dann auf den Kopf. Schneiden Sie mit einem Präpariermikroskop und einer Rasierklinge die halbporöse Membran aus dem Transwell und wenden Sie Schneidkraft an der Verbindungsstelle zwischen Membran und Transwell an.
        Anmerkungen: Achten Sie darauf, wie nah der Schnitt an der Lippe des Transwell gemacht wird, da die Transwell-Membran dazu neigt, sich zu verziehen und zu knittern, wenn die Schnitte nicht gleichmäßig sind.
      3. Sobald die Transwell-Membran durchtrennt ist, legen Sie sie sofort mit einer Pinzette auf einen Objektträger, wobei Sie darauf achten sollten, dass Teile der Transwell-Membran nicht mit Zellen berührt werden. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Task-Tuch und vermeiden Sie es, die Zellen zu berühren. Fügen Sie Eindeckmaterial und ein Deckglas hinzu. Stellen Sie sicher, dass Sie den Überblick behalten, welche Seite des Transwell "mit der rechten Seite nach oben" ist, wenn Sie das Transwell eindecken.
      4. Erfassen Sie die Autofluoreszenzintensität und die Spektren mit den gleichen Einstellungen und Verfahren wie in Schritt 1.3.1.4 und Schritt 1.3.1.5.
        HINWEIS: Bei der Bildgebung von UAM ist ein wichtiger Störfaktor, dass OxOS autofluoreszierend sind und oft tage- und manchmal sogar wochenlang nach Abschluss der OxOS-Fütterung an der apikalen Oberfläche des RPE haften. Daher muss bei der Quantifizierung von UAM eine Methode angewendet werden, um sicherzustellen, dass die gemessene Autofluoreszenz von UAM und nicht von OxOS stammt. Die einfachste Methode ist die Kofärbung von Lipofuszinkulturen mit einem Rhodopsin-Antikörper. Beispielsweise kann der Anti-Rhodopsin-Antikörper 4D2 in einer Verdünnung von 1:1000 und mit einem Standardprotokoll für die PFA-Fixierung der Immunzytochemie34 verwendet werden. Der Sekundärantikörper für Rhodopsin sollte ein dunkelroter Farbstoff-konjugierter Antikörper sein (z.B. mit einem Anregungsmaximum nahe 647 nm), da UAM- und OxOS-Autofluoreszenz in dieser Wellenlänge tendenziell am schwächsten ist. Konfokale Bilder können dann sequentiell in zwei Kanälen aufgenommen werden, wobei die UAM- und OxOS-Autofluoreszenz mit einem 405-nm-Laser und die Emission von 415 nm bis 550 nm angeregt werden, während Rest-Rhodopsin, das auf unverdautes OxOS hinweist, mit Standard-Bildgebungsparametern für den Fernröte-Farbstoff in einem separaten Kanal angeregt werden kann. Nach der Aufnahme kann der Rhodopsinkanal als subtraktive Maske in einem Programm wie ImageJ verwendet werden, um die Autofluoreszenz zu entfernen, die von klebrigem verbleibendem OxOS stammt, so dass nur die UAM-Autofluoreszenz zur Quantifizierung übrig bleibt.
        VORSICHT: Selbst Betriebssysteme, die nicht photooxidiert sind, weisen eine gewisse Autofluoreszenz auf, und selbst bei gründlichem Waschen haften einige Betriebssysteme und OxOS an der RPE-Oberfläche. Ohne die Erzeugung einer subtraktiven Maske mittels Rhodopsin-Immunfärbung, wie im obigen HINWEIS vorgeschlagen, ist eine genaue Quantifizierung der UAM-Autofluoreszenzwerte in Kulturen, die mit OxOs oder Standard-OS gefüttert wurden, nicht möglich.
    2. Gleichzeitige Detektion von Lipofuscin-ähnlichen Granula und anderen Immunfluoreszenzmarkern
      HINWEIS: Wie in Schritt 2.3.1 beschrieben, schränkt das breite Autofluoreszenzspektrum von Lipofuszin die Auswahl für die Fluoreszenz-Co-Färbung ein. Die folgenden Methoden können in Betracht gezogen werden, um die Co-Färbung zu erleichtern.
      1. Verwenden Sie einen dunkelroten Fluorophor. Die Autofluoreszenz von Lipofuszin ist im nahen Infrarot schwach. Daher kann die Verwendung eines dunkelroten Farbstoffs für die Fluoreszenzdetektion eines interessierenden Antigens in Kombination mit sorgfältigen Anpassungen der Kanaleinstellungen an einem konfokalen Mikroskop in der Regel Autofluoreszenz von Co-Färbefluoreszenz unterscheiden.
      2. Nutzen Sie den langen Fluoreszenz-Emissionsschweif von Lipofuscin.
        HINWEIS: Da Lipofuszin ein sehr breites Fluoreszenzemissionsspektrum hat, kann es oft bei einer niedrigen nm-Wellenlänge (z. B. 405-nm-Laser) angeregt werden und die Emission wird immer noch im orange/roten Teil des Spektrums (z. B. 585-635 nm) detektiert. Diese einzigartige Kombination aus Anregungs- und Emissionswellenlängen kann oft um einen anderen Co-färbenden Fluorophor herum zugeschnitten werden.
        1. Detektieren Sie das interessierende Antigen mit einem Fluorophor mit einer maximalen Anregung von etwa 488 nm und einer Emissionsdetektion bei 500-530 nm. Aufbau eines separaten Kanals für die Autofluoreszenzdetektion mit 405 nm Anregung und 585-635 nm Emission. Dieser zweite Kanal detektiert nur UAM, während der erste Kanal das interessierende Antigen plus Lipofuscin detektiert.
        2. Verwenden Sie mit einem Freeware-Programm wie ImageJ diesen zweiten reinen UAM-Kanal als subtraktive Maske, um das UAM-Signal aus dem ersten Kanal zu entfernen (der sowohl das Antigensignal als auch das UAM-Signal enthält).
      3. Nutzen Sie die spektrale Entmischung. Die meisten modernen konfokalen Mikroskope verfügen über eine spektrale Entmischungsoption. Dies ermöglicht es, das Spektrum einer Probe nur mit UAM und einer anderen Probe nur mit dem interessierenden Co-Färbungsfluorophor zu erfassen. Die experimentelle Probe, die sowohl UAM als auch den Co-Färbungs-Fluorophor enthält, kann dann aufgenommen und linearen Entmischungsmethoden unterzogen werden, um zu berechnen, wie viel Prozent des Signals aus Autofluoreszenz im Vergleich zur Co-Färbung stammen.
        HINWEIS: Umfassende Anleitungen zur spektralen Entmischung sind mit den meisten modernen konfokalen Mikroskopen verfügbar.
      4. Nutzen Sie die Bildgebung mit Fluoreszenzlebensdauer. Während das Emissionsspektrum zwischen UAM und einem Co-färbenden Fluorophor von Interesse ähnlich sein kann, ist es wahrscheinlich, dass sich ihre Fluoreszenzlebensdauer erheblich unterscheidet. Im Allgemeinen weist UAM eine kürzere Fluoreszenzlebensdauer auf als die meisten spezifischen Fluorophore. Mit dem Zugang zu einem konfokalen Mikroskop, das eine lebenslange Bildgebung ermöglicht, kann man Fluoreszenzsignale erfassen, um diejenigen zu erkennen, die länger als die typische Lebensdauer von Lipofuszin sind.
        HINWEIS: Im Allgemeinen reduziert die Lebensdauer der Gate-Fluoreszenz bei Signalen, die länger als 2 ns sind, die UAM-Kontamination erheblich, obwohl das Signal dadurch nicht vollständig eliminiert wird.
      5. Verwendung eines Autofluoreszenz-Suppressors. Traditionell wird Sudan Black verwendet, um die Autofluoreszenz vor der spezifischen Immunfluoreszenzfärbung zu löschen35. Mehrere kommerziell erhältliche Autofluoreszenz-Quencher-Produkte berichten, dass sie die Ergebnisse von Sudan Black verbessert haben, und diese Produkte sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Autofluoreszenzlöschung zerstört natürlich die Fähigkeit, Lipofuscin nachzuweisen.
    3. Bestimmung der Zusammensetzung von Lipofuscin-ähnlichen Granulaten
      1. Beurteilung neutraler Lipide
        1. Fixieren Sie UAM-beladenes RPE und kontrollieren Sie die Vertiefungen (mit unbehandeltem OS gefüttert) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA und waschen Sie sie 5x lang mit PBS.
        2. Färbung für neutrale Lipide mit entweder 10 μg/ml Nilrot oder 3,33 μg/ml Bodipy 493/503 in einer 3%igen BSA-PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 1 h, gefolgt von Waschen mit PBS für 5 min 3x.
        3. Schneiden Sie Transwell aus und montieren Sie es wie in Schritt 2.3.1.2 und 2.3.1.3 und das Bild. Verwenden Sie im Allgemeinen die folgenden Anregungs- und Emissionsbandbreiten für die Bildgebung: Nilrot - ex 543 nm, em 620-700 nm und Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Beurteilung von verestertem und nicht verestertem Cholesterin
        1. Befolgen Sie Schritt 2.3.3.1.1
        2. Filipin ist ein fluoreszierender Farbstoff, der nicht verestertes Cholesterin, aber kein verestertes Cholesterin erkennt36. Um die Menge an Gesamtcholesterin (nicht verestert und verestert) im UAM zu bestimmen, wird die Probe zunächst mit Cholesterinesterase vorbehandelt, um verestertes Cholesterin in unverestertes Cholesterin umzuwandeln. Behandeln Sie die Zellen mit 20 U/ml Cholesterinesterase in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) (siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 3,5 h, gefolgt von Waschen mit PBS für 5 min 3x.
        3. Mit 50 μg/ml Filipin (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur 1 h in PBS färben und 3x mit PBS 5 min waschen. Halten Sie die Proben abgedeckt und vor Licht geschützt, da philippinische Photobleichmittel leicht sind.
          HINWEIS: Wenn nur unverestertes Cholesterin quantifiziert werden soll, kann die Cholesterinesterase in Schritt 2.3.3.2.2 übersprungen werden. Wenn die Menge an verestertem Cholesterin quantifiziert werden soll, kann sie aus der Differenz zwischen dem Gesamtcholesterin und dem unveresterten Cholesterin in der Probe abgeleitet werden.
        4. Schneiden Sie Transwell aus und montieren Sie es wie in den Schritten 2.3.1.2 und 2.3.1.3 und das Bild.
          HINWEIS: Bei der Bildgebung von Filipin bleicht es sehr schnell aus. Man muss die Intensität und Dauer der Anregung minimieren und damit rechnen, dass es sogar zu einer gewissen Photobleichung kommen kann, wenn man die Probe durch das Okular betrachtet. Daher sollte man bei der Bildgebung: (1) nach einem geeigneten Bereich für die Aufnahme mit einem anderen Fluoreszenzkanal als dem Filipin-Kanal suchen, (2) Filipin auf einem Weitfeldmikroskop statt mit einem konfokalen Mikroskop abbilden (um die Intensität der Lichtexposition zu begrenzen) und (3) die wiederholte Abbildung eines Bereichs vermeiden. Im Allgemeinen werden die folgenden Anregungs- und Emissionsbandbreiten für die Abbildung von Filipin verwendet - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Bewertung der Auswirkungen von Lipofuscin-ähnlichen Granula auf die RPE-Phagozytose: Gesamtkonsumkapazität

HINWEIS: Die Gründe für die Messung der OS-Phagozytose über das OS-Puls-Only-Protokoll unten werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" detailliert beschrieben. Die Methode, die als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet wird, vermeidet Unklarheiten über die Effizienz der Phagozytose, die bei herkömmlichen OS-Pulse-Chase-Phagozytose-Assays auftreten können. Die Assays werden auf 24-Well-Transwell-Platten unter Verwendung von 50 μl Medien mit 4 x 106 OS/ml durchgeführt.

  1. Berechnen Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Vertiefungen und tauen Sie dann eine geeignete Menge regulären OS auf, drehen Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2400 x g herunter und resuspendieren Sie sie in Standard-RPE-Zellkulturmedien auf 4 x 106 OS/ml. Fügen Sie überbrückende Liganden hinzu, um die Phagozytoseraten zu erleichtern.
    HINWEIS: Die Endkonzentration der Brückenliganden in den zu fütternden Medien beträgt 4 μg/ml für Protein S und 1,5 μg/ml für MFG-E8. Wie in Schritt 1.1.11 beschrieben, müssen die Konzentrationen von Brückenliganden möglicherweise für andere RPE-Typen oder Zelldichten geändert werden.
  2. Entfernen Sie apikales Medium und fügen Sie 50 μL 4 x 106 OS/ml hinzu, idealerweise mit entsprechenden Konzentrationen an brückenbildenden Liganden.
  3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von OS (z. B. - 0 h, 1 h, 4 h und 24 h) werden 16,67 μL 4x Laemmli-Probenpuffer mit Proteaseinhibitoren hinzugefügt, um beide Zellen und den darüber liegenden OS-haltigen Überstand zu lysieren. Verwenden Sie eine P-200-Pipette, um die Transwell-Oberfläche zu zerkratzen, und achten Sie darauf, die Transwell-Membran nicht zu durchstechen oder die Membran vom Transwell zu lösen, und sammeln Sie den kombinierten Zellüberstand und das Zelllysat zusammen. Wirbeln, herunterschleudern und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um eine gründliche Denaturierung zu ermöglichen.
    VORSICHT: Trotz der Verwendung von Probenpuffer zur Lyse des OS sollte die Lyselösung anschließend nicht erhitzt werden, da dies eine Rhodopsin-Aggregation auslösen kann. Vermeiden Sie es auch, das lysierte OS bis zur Lagerung abzukühlen, da dies Protein ausfällt. Frieren Sie unbenutzte Lysate bei -20 °C ein und stellen Sie sicher, dass die Lysate vor der Verwendung vollständig aufgetaut sind.
  4. Führen Sie Lysate auf SDS PAGE mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 1.3.3 aus und laden Sie gleiche Mengen an Lysaten pro Well. GAPDH, β-Aktin oder ein anderes Housekeeping-Protein sollten verwendet werden, um die Zellzahl zu normalisieren, da die Phagozytoseraten von der Zellzahl abhängen.
  5. Sondieren Sie Western-Blots mit Antikörpern gegen den N- oder C-Terminus von Rhodopsin. Verwenden Sie die standardmäßigen Western-Blotting-Bedingungen, und Antikörperverdünnungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
    HINWEIS: Unterhalb des Rhodopsin-Hauptbandes befinden sich mehrere Rhodopsin-Fragmente. Diese Fragmente stellen teilweise verdautes Rhodopsin dar, ein Prozess, der vor der Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom32,33 beginnt. Eine Erhöhung der Anzahl von Rhodopsin-Fragmenten im UAM-beladenen RPE im Vergleich zum Kontroll-RPE könnte auf einen nachgeschalteten Defekt der Phagolysosomenkapazität auf der Ebene der Phagosom-Lysosom-Fusion, der lysosomalen Ansäuerung und/oder der abbauenden Enzymfunktion hinweisen 16,34,35.

Ergebnisse

Der Aufbau für die Photooxidation des OS ist in Abbildung 1Ai demonstriert. Die mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger ermöglichen es, ein großes Volumen an OS in Lösung pro offenem Rechteck zu laden, ohne sich auf den Rest des Objektträgers auszubreiten. Der Objektträger mit OS befindet sich in einer sterilen Petrischale mit abgenommenem Deckel, und eine UV-Lampe wird über den Objektträger gelegt, wie in Abbildung 1Aii gezeigt. Alternativ...

Diskussion

Während RPE-Lipofuszin seit Jahrzehnten untersucht wird, ist seine Toxizität umstritten 2,9,16,42. Angesichts der Unklarheit über die Toxizität von Lipofuszin aus Tiermodellen11 sind In-vitro-Modelle mit humanem RPE wertvoll. Es wurde eine Reihe von In-vitro-Lipofuszin-Akkumulationsmodellen beschrieben, aber keines hat sowohl OS-Fütterung als auch hochreife...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse der Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), von Fight for Sight (FFS) und der International Retinal Research Foundation (IRRF) unterstützt. J.M.L.M. wird derzeit durch ein K08-Stipendium des National Eye Institute (EY033420) unterstützt. Für die HFT-Forschung wurden keine Bundesmittel verwendet. Weitere Unterstützung kommt von der James Grosfeld Initiative for Dry AMD und den folgenden privaten Spendern: Barbara Dunn und Dee &; Dickson Brown.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

Referenzen

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiologieHeft 194LipofuscinRetinales Pigmentepithel RPEPhotorezeptorspitzen oder fragmente OSPhagozytoseMorbus StargardtAltersbedingte Makuladegeneration AMDUnverdauliches Autofluoreszenzmaterial UAM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten