Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Zusammenfassung

Die tägliche Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente durch das retinale Pigmentepithel (RPE) trägt zur Akkumulation eines intrazellulären Alterungspigments bei, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Die Toxizität von Lipofuszin ist bei Morbus Stargardt, der häufigsten erblichen Netzhautdegeneration, gut belegt, ist aber bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, umstrittener. Die Bestimmung der Lipofuszin-Toxizität beim Menschen war schwierig, und Tiermodelle von Stargardt weisen eine begrenzte Toxizität auf. Daher werden In-vitro-Modelle benötigt, die humanes RPE in vivo nachahmen, um die Bildung, Clearance und Toxizität von Lipofuszin besser zu verstehen. Die meisten bisherigen Liofuszin-Modelle in Zellkulturen wurden in Zelllinien oder mit einer einzigen Komponente der komplexen Lipofuszinmischung gefüttert, anstatt mit Fragmenten/Spitzen des gesamten äußeren Segments des Photorezeptors, wodurch ein vollständigeres und physiologischeres Lipofuszin-Modell entsteht. Hier wird eine Methode beschrieben, um die Akkumulation von Lipofuscin-ähnlichem Material (unverdauliches Autofluoreszenzmaterial oder UAM) in hochdifferenzierten primären humanen pränatalen RPE (hfRPE) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten RPE zu induzieren. UAM, akkumuliert in Kulturen durch wiederholte Fütterung von mit ultraviolettem Licht behandelten OS-Fragmenten, die vom RPE über Phagozytose aufgenommen wurden. Die wichtigsten Möglichkeiten, wie sich UAM in vivo Lipofuszin annähert und von diesem unterscheidet, werden ebenfalls diskutiert. Begleitend zu diesem Modell der Lipofuscin-ähnlichen Akkumulation werden bildgebende Verfahren zur Unterscheidung des breiten Autofluoreszenzspektrums von UAM-Granula von gleichzeitiger Antikörperfärbung vorgestellt. Um den Einfluss von UAM auf die RPE-Phagozytosekapazität zu bewerten, wurde schließlich eine neue Methode zur Quantifizierung der Aufnahme und des Abbaus von Fragmenten/Spitzen des äußeren Segments eingeführt. Diese Methode, die als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet wird, überwindet mögliche Fehlinterpretationen der RPE-Phagozytose-Kapazität, die klassischen "Pulse-Chase"-Assays im äußeren Segment innewohnen. Die hier vorgestellten Modelle und Techniken können verwendet werden, um die Entwicklung und Clearance von Lipofuszinen sowie die mutmaßliche Toxizität zu untersuchen.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) bietet eine wichtige Unterstützung für die darüber liegenden Photorezeptoren, einschließlich der täglichen Aufnahme und des Abbaus von Photorezeptorspitzen oder -fragmenten (in diesem Protokoll steht die Abkürzung OS eher für OS-Spitzen oder -Fragmente als für ganze äußere Segmente). Diese tägliche Aufnahme des postmitotischen RPE überlastet schließlich die phagolysosomale Kapazität und führt zur Ansammlung von unverdaulichem, autofluoreszierendem intrazellulärem Material, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Interessanterweise haben mehrere Studien auch gezeigt, dass RPE-Lipofuszin auch ohne OS-Phagozytose akkumulieren kann

Protokoll

Das vorliegende Protokoll, das den Erwerb und die Verwendung von menschlichem Gewebe vorsieht, wurde vom Institutional Review Board der University of Michigan geprüft und genehmigt (HUM00105486).

1. Präparation von photooxidierten äußeren Segmentspitzen und -fragmenten

HINWEIS: Die an Dunkelheit angepasste Rindernetzhaut wurde gekauft und auf Eis versandt (siehe Materialtabelle). Von diesen Netzhäuten wurden die OS nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll^{gereinigt 23}.

1. Vernetzung des äußeren Segments mit einer UV-Lampe
   1. Tauchen Sie die mit Polytetrafluore....

Diskussion

Während RPE-Lipofuszin seit Jahrzehnten untersucht wird, ist seine Toxizität umstritten 2,9,16,42. Angesichts der Unklarheit über die Toxizität von Lipofuszin aus Tiermodellen¹¹ sind In-vitro-Modelle mit humanem RPE wertvoll. Es wurde eine Reihe von In-vitro-Lipofuszin-Akkumulationsmodellen beschrieben, aber keines hat sowohl OS-Fütterung als auch hochreife.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000