Amélioration des modèles de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales de pigments rétiniens humains hautement polarisés

Résumé

Ce protocole décrit un modèle d’accumulation de lipofuscine dans des cultures épithéliales de pigment rétinien humain (EPR) hautement différenciées et polarisées et un test de phagocytose du segment externe (SG) amélioré pour détecter la capacité totale de consommation/dégradation de la SG de l’EPR. Ces méthodes surmontent les limites des modèles précédents de lipofuscine et des tests classiques de phagocytose du segment externe par impulsions.

Résumé

La phagocytose quotidienne des segments externes du photorécepteur par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) contribue à l’accumulation d’un pigment de vieillissement intracellulaire appelé lipofuscine. La toxicité de la lipofuscine est bien établie dans la maladie de Stargardt, la dégénérescence rétinienne héréditaire la plus courante, mais est plus controversée dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité irréversible dans le monde développé. Déterminer la toxicité de la lipofuscine chez l’homme a été difficile, et les modèles animaux de Stargardt ont une toxicité limitée. Ainsi, des modèles in vitro qui imitent l’EPR humain in vivo sont nécessaires pour mieux comprendre la génération, la clairance et la toxicité de la lipofuscine. La majorité des modèles de lipofuscine de culture cellulaire à ce jour ont été dans des lignées cellulaires ou ont impliqué l’alimentation en EPR d’un seul composant du mélange complexe de lipofuscine plutôt que de fragments / pointes de l’ensemble du segment externe du photorécepteur, ce qui génère un modèle lipofuscine plus complet et physiologique. La méthode décrite ici est une méthode pour induire l’accumulation de matériel de type lipofuscine (appelé matériau d’autofluorescence non digestible, ou UAM) dans l’EPR prénatal primaire humain hautement différencié (hfRPE) et l’EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (CSPi). L’UAM s’est accumulée dans les cultures par des alimentations répétées de fragments de SG traités à la lumière ultraviolette absorbés par l’EPR par phagocytose. Les principales façons dont UAM se rapproche et diffère de la lipofuscine in vivo sont également discutées. Parallèlement à ce modèle d’accumulation de type lipofuscine, des méthodes d’imagerie permettant de distinguer le large spectre d’autofluorescence des granules UAM de la coloration simultanée des anticorps sont introduites. Enfin, pour évaluer l’impact de la MNA sur la capacité de phagocytose de l’EPR, une nouvelle méthode de quantification de l’absorption et de la dégradation des fragments et des pointes du segment externe a été introduite. Appelée « capacité totale de consommation », cette méthode permet de surmonter les erreurs potentielles d’interprétation de la capacité de phagocytose de l’EPR inhérentes aux tests classiques de « chasse au pouls » du segment externe. Les modèles et les techniques présentés ici peuvent être utilisés pour étudier les voies de génération et de clairance de la lipofuscine et la toxicité putative.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) fournit un soutien essentiel pour les photorécepteurs sus-jacents, y compris l’absorption quotidienne et la dégradation des extrémités ou des fragments du segment externe du photorécepteur (dans ce protocole, l’abréviation OS signifie embouts ou fragments OS plutôt que segments externes entiers). Cette absorption quotidienne de l’EPR post-mitotique finit par surcharger la capacité phagolysosomale et conduit à l’accumulation de matériel intracellulaire autofluorescent non digestible, appelé lipofuscine. Fait intéressant, plusieurs études ont également démontré que la lipofuscine RPE peut s’accumuler sans phagocytose

Protocole

Le présent protocole concernant l’acquisition et l’utilisation de tissus humains a été examiné et approuvé par le comité d’examen institutionnel de l’Université du Michigan (HUM00105486).

1. Préparation des extrémités et des fragments du segment extérieur photo-oxydés

REMARQUE : Des rétines bovines adaptées à l’obscurité ont été achetées et expédiées sur glace (voir le tableau des matières). À partir de ces rétines, les OS ont été purifiés selon un protocole²³ publié précédemment.

1. Réticulation du segment extérieur avec une lampe UV
   1. Plonger complètement les....

Discussion

Alors que la lipofuscine RPE a été étudiée pendant des décennies, sa toxicité est débattue 2,9,16,42. Compte tenu de l’ambiguïté sur la toxicité de la lipofuscine à partir de modèles animaux¹¹, les modèles in vitro utilisant l’EPR humaine sont précieux. Une gamme de modèles d’accumulation de lipofuscine in vitro a été décrite, ma.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000