Miglioramento dei modelli di lipofuscina e quantificazione della capacità di fagocitosi del segmento esterno in colture epiteliali di pigmenti retinici umani altamente polarizzate

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello di accumulo di lipofuscina in colture epiteliali di pigmenti retinici (RPE) umane altamente differenziate e polarizzate e un test di fagocitosi del segmento esterno (OS) migliorato per rilevare il consumo totale di OS / capacità di degradazione dell'RPE. Questi metodi superano i limiti dei precedenti modelli di lipofuscina e dei classici saggi di fagocitosi del segmento esterno a inseguimento del polso.

Abstract

La fagocitosi quotidiana dei segmenti esterni dei fotorecettori da parte dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) contribuisce all'accumulo di un pigmento di invecchiamento intracellulare chiamato lipofuscina. La tossicità della lipofuscina è ben consolidata nella malattia di Stargardt, la più comune degenerazione retinica ereditaria, ma è più controversa nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nel mondo sviluppato. Determinare la tossicità della lipofuscina nell'uomo è stato difficile e i modelli animali di Stargardt hanno una tossicità limitata. Pertanto, sono necessari modelli in vitro che imitano l'RPE umano in vivo per comprendere meglio la generazione, la clearance e la tossicità della lipofuscina. La maggior parte dei modelli di lipofuscina di colture cellulari fino ad oggi sono stati in linee cellulari o hanno coinvolto l'alimentazione di RPE con un singolo componente della miscela complessa di lipofuscina piuttosto che frammenti / punte dell'intero segmento esterno del fotorecettore, che genera un modello di lipofuscina più completo e fisiologico. Qui è descritto un metodo per indurre l'accumulo di materiale simile alla lipofuscina (definito materiale di autofluorescenza indigeribile, o UAM) in RPE prenatale umano primario altamente differenziato (hfRPE) e RPE derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'UAM si è accumulata nelle colture mediante ripetute alimentazioni di frammenti di OS trattati con luce ultravioletta assorbiti dall'RPE tramite fagocitosi. Vengono anche discussi i modi chiave in cui UAM si avvicina e differisce dalla lipofuscina in vivo . Accompagnando questo modello di accumulo simile alla lipofuscina, vengono introdotti metodi di imaging per distinguere l'ampio spettro di autofluorescenza dei granuli di UAM dalla concomitante colorazione anticorpale. Infine, per valutare l'impatto dell'UAM sulla capacità di fagocitosi RPE, è stato introdotto un nuovo metodo per quantificare l'assorbimento e la rottura di frammenti/punte del segmento esterno. Definito "Total Consumptive Capacity", questo metodo supera potenziali interpretazioni errate della capacità di fagocitosi RPE inerente ai classici saggi di "inseguimento a impulsi" del segmento esterno. I modelli e le tecniche qui introdotte possono essere utilizzati per studiare la generazione di lipofuscina e le vie di clearance e la tossicità putativa.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) fornisce un supporto critico per i fotorecettori sovrastanti, compresa l'assorbimento e la degradazione quotidiana delle punte o dei frammenti del segmento esterno dei fotorecettori (in tutto questo protocollo, l'abbreviazione OS sta per punte o frammenti di OS piuttosto che interi segmenti esterni). Questo assorbimento giornaliero nell'RPE post-mitotico alla fine sovraccarica la capacità fagolisosomiale e porta all'accumulo di materiale intracellulare autofluorescente non digeribile, chiamato lipofuscina. È interessante notare che diversi studi hanno anche dimostrato che la lipofuscina RPE può accumularsi senza fagocitosi OS

Protocollo

Il presente protocollo che prevede l'acquisizione e l'uso di tessuti umani è stato esaminato e approvato dall'Institutional Review Board dell'Università del Michigan (HUM00105486).

1. Preparazione di punte e frammenti di segmenti esterni fotoossidati

NOTA: Le retine bovine adattate al buio sono state acquistate e spedite su ghiaccio (vedi Tabella dei materiali). Da queste retine, le OS sono state purificate seguendo un protocollo²³ precedentemente pubblicato.

1. Reticolazione del segmento esterno con una lampada UV
   1. Immergere completamente i vetrini rivestiti ....

Discussione

Mentre RPE lipofuscin è stato studiato per decenni, la sua tossicità è dibattuta 2,9,16,42. Data l'ambiguità sulla tossicità della lipofuscina da modelli animali¹¹, i modelli in vitro che utilizzano RPE umano sono preziosi. È stata descritta una serie di modelli di accumulo di lipofuscina in vitro, ma nessuno ha utilizzato sia l'alimentazione OS c.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000