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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello di accumulo di lipofuscina in colture epiteliali di pigmenti retinici (RPE) umane altamente differenziate e polarizzate e un test di fagocitosi del segmento esterno (OS) migliorato per rilevare il consumo totale di OS / capacità di degradazione dell'RPE. Questi metodi superano i limiti dei precedenti modelli di lipofuscina e dei classici saggi di fagocitosi del segmento esterno a inseguimento del polso.

Abstract

La fagocitosi quotidiana dei segmenti esterni dei fotorecettori da parte dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) contribuisce all'accumulo di un pigmento di invecchiamento intracellulare chiamato lipofuscina. La tossicità della lipofuscina è ben consolidata nella malattia di Stargardt, la più comune degenerazione retinica ereditaria, ma è più controversa nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nel mondo sviluppato. Determinare la tossicità della lipofuscina nell'uomo è stato difficile e i modelli animali di Stargardt hanno una tossicità limitata. Pertanto, sono necessari modelli in vitro che imitano l'RPE umano in vivo per comprendere meglio la generazione, la clearance e la tossicità della lipofuscina. La maggior parte dei modelli di lipofuscina di colture cellulari fino ad oggi sono stati in linee cellulari o hanno coinvolto l'alimentazione di RPE con un singolo componente della miscela complessa di lipofuscina piuttosto che frammenti / punte dell'intero segmento esterno del fotorecettore, che genera un modello di lipofuscina più completo e fisiologico. Qui è descritto un metodo per indurre l'accumulo di materiale simile alla lipofuscina (definito materiale di autofluorescenza indigeribile, o UAM) in RPE prenatale umano primario altamente differenziato (hfRPE) e RPE derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'UAM si è accumulata nelle colture mediante ripetute alimentazioni di frammenti di OS trattati con luce ultravioletta assorbiti dall'RPE tramite fagocitosi. Vengono anche discussi i modi chiave in cui UAM si avvicina e differisce dalla lipofuscina in vivo . Accompagnando questo modello di accumulo simile alla lipofuscina, vengono introdotti metodi di imaging per distinguere l'ampio spettro di autofluorescenza dei granuli di UAM dalla concomitante colorazione anticorpale. Infine, per valutare l'impatto dell'UAM sulla capacità di fagocitosi RPE, è stato introdotto un nuovo metodo per quantificare l'assorbimento e la rottura di frammenti/punte del segmento esterno. Definito "Total Consumptive Capacity", questo metodo supera potenziali interpretazioni errate della capacità di fagocitosi RPE inerente ai classici saggi di "inseguimento a impulsi" del segmento esterno. I modelli e le tecniche qui introdotte possono essere utilizzati per studiare la generazione di lipofuscina e le vie di clearance e la tossicità putativa.

Introduzione

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) fornisce un supporto critico per i fotorecettori sovrastanti, compresa l'assorbimento e la degradazione quotidiana delle punte o dei frammenti del segmento esterno dei fotorecettori (in tutto questo protocollo, l'abbreviazione OS sta per punte o frammenti di OS piuttosto che interi segmenti esterni). Questo assorbimento giornaliero nell'RPE post-mitotico alla fine sovraccarica la capacità fagolisosomiale e porta all'accumulo di materiale intracellulare autofluorescente non digeribile, chiamato lipofuscina. È interessante notare che diversi studi hanno anche dimostrato che la lipofuscina RPE può accumularsi senza fagocitosi OS 1,2. La lipofuscina ha molti componenti, compresi gli addotti reticolati derivati dai retinoidi del ciclo visivo e può occupare quasi il 20% del volume delle cellule RPE per quelli di età superiore agli 803.

Se la lipofuscina è tossica è stato oggetto di accesi dibattiti. La malattia di Stargardt è una degenerazione autosomica recessiva dei fotorecettori e dell'RPE in cui una mutazione in ABCA4 innesca un'elaborazione impropria dei retinoidi del ciclo visivo contenuti nei segmenti esterni dei fotorecettori. L'elaborazione impropria dei retinoidi porta alla reticolazione aberrante e alla formazione di specie di bis-retinoidi, tra cui il bis-retinoide N-retiniletanamina (A2E). Gli studi hanno dimostrato molteplici meccanismi per la tossicità di A2E 4,5. La lipofuscina contribuisce ai segnali di autofluorescenza del fondo oculare durante l'imaging clinico e sia i pazienti di Stargardt che i modelli animali mostrano una maggiore autofluorescenza del fondo prima della degenerazione retinica, suggerendo una correlazione tra i livelli di lipofuscina e la tossicità 6,7. Tuttavia, con l'età, la lipofuscina si accumula in tutti gli esseri umani senza innescare una degenerazione RPE. Inoltre, nella degenerazione maculare legata all'età (AMD), dove la degenerazione RPE si verifica solo nei pazienti anziani, quelli con forme precoci e intermedie della malattia hanno meno segnali di autofluorescenza del fondo oculare rispetto agli esseri umani non malati di pari età8. Questi risultati clinici sono stati verificati anche a livello istologico 9,10.

I modelli animali di accumulo di lipofuscina RPE hanno anche lasciato qualche ambiguità sulla tossicità della lipofuscina. Il topo knockout ABCA4 non mostra degenerazione retinica su uno sfondo pigmentato, mentre lo fa su uno sfondo albino o quando esposto alla luce blu11,12. Inoltre, la tossicità della lipofuscina derivata tramite knockout ABCA4 probabilmente differisce dalla lipofuscina che si accumula più lentamente che si verifica con l'invecchiamento naturale, come visto in AMD13.

I modelli in vitro di accumulo di lipofuscina forniscono un'alternativa allo studio degli effetti dell'accumulo di lipofuscina sulla salute dell'RPE. Tali modelli consentono di manipolare i componenti della lipofuscina, dall'alimentazione di singoli componenti retinoidi all'alimentazione di OS, e consentono lo studio nell'RPE umano piuttosto che animale. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati diversi metodi per modellare la lipofuscina RPE in coltura. Insieme ad altri gruppi, il gruppo del Dr. Boulton ha alimentato quotidianamente OS bovini per un massimo di tre mesi sul passaggio da 4 a 7 cellule RPE primarie umane da donatori di età compresa tra 4 e 85 anni14. In alternativa, l'inibizione dell'autofagia ha anche portato all'accumulo di lipofuscina nei passaggi da 3 a 7 colture RPE umane primarie15. Tuttavia, l'inibizione lisosomiale sub-letale in colture di RPE prenatale umana primaria (hfRPE) altamente differenziate, di passaggio 1, non è riuscita a indurre lipofuscina, anche con l'aggiunta ripetuta di OS su base giornaliera16.

Come approccio più riduzionista, altri hanno alimentato singoli componenti di lipofuscina alle colture, in particolare il bis-retinoide A2E 4,17. Tali studi sono preziosi in quanto definiscono potenziali meccanismi diretti di tossicità per i singoli componenti della lipofuscina, implicando, ad esempio, il colesterolo lisosomiale e l'omeostasi della ceramide18. Allo stesso tempo, c'è un dibattito sulla tossicità di A2E19 e alimentarlo direttamente alle cellule aggira il percorso tipico per l'accumulo di lipofuscina, che coinvolge la fagocitosi del fotorecettore OS. Nel tentativo di fornire tutti i componenti della lipofuscina alle colture RPE, Boulton e Marshall hanno purificato la lipofuscina dagli occhi umani e l'hanno alimentata al passaggio da 4 a 7 colture RPE primarie umane derivate da donatori umani sia fetali che anziani20. Sebbene innovativo, questo metodo rappresenta una fonte limitata di lipofuscina per esperimenti ripetuti.

Mentre ripetute somministrazioni di OS a colture RPE producono lipofuscina in molti sistemi, non riescono a farlo in colture RPE primarie altamente differenziate16. Il sistema operativo fotoossidante induce reazioni di reticolazione incrociata come la formazione di bis-retinoidi che si verifica naturalmente durante la formazione di lipofuscina in vivo. Questo può accelerare la formazione di granuli simili a lipofuscine nei sistemi di coltura RPE, anche quelli che sono altamente differenziati e resistenti all'accumulo di lipofuscina16. Qui viene introdotto un metodo per indurre l'accumulo di granuli simili alla lipofuscina in hfRPE altamente differenziato e iPSC-RPE umano, modificato dal protocollo21 pubblicato da Wihlmark. Questo metodo ha il vantaggio di indurre granuli simili a lipofuscina impiegando la stessa fonte (OS fotorecettore) e la stessa via (assorbimento di OS fagolisosomiale) come avviene per la lipofuscinogenesi in vivo. Inoltre, viene fatto su colture di RPE umane che sono altamente differenziate e convalidate in più studi per replicare RPE umano in vivo22,23,24. Questi granuli simili alla lipofuscina sono definiti materiale autofluorescente indigeribile (UAM) e forniscono dati e discussioni in questo protocollo confrontando UAM con lipofuscina in vivo. Insieme ai metodi per costruire e valutare colture cariche di UAM in RPE umano altamente differenziato, viene introdotto anche un metodo aggiornato per valutare la fagocitosi di RPE OS. Sono stati introdotti diversi metodi eccellenti per quantificare la fagocitosi della OS, tra cui Western blotting, immunocitochimica e FACS25,26,27. Tuttavia, all'inizio della caccia all'impulso del sistema operativo, le condizioni che portano a uno scarso assorbimento del sistema operativo possono essere confuse con condizioni che promuovono un rapido degrado del sistema operativo interiorizzato. Il metodo qui presentato misura la quantità totale di sistema operativo introdotto che viene completamente consumata / degradata dall'RPE ("Total Consumptive Capacity"), contribuendo a eliminare questa ambiguità. Si prevede che le intuizioni sulla tossicità della lipofuscina utilizzando questi protocolli, compresi gli effetti sui tassi di fagocitosi di OS utilizzando il metodo "Total Consumptive Capacity", saranno utilizzate per far luce sulla tossicità della lipofuscina in vivo.

Protocollo

Il presente protocollo che prevede l'acquisizione e l'uso di tessuti umani è stato esaminato e approvato dall'Institutional Review Board dell'Università del Michigan (HUM00105486).

1. Preparazione di punte e frammenti di segmenti esterni fotoossidati

NOTA: Le retine bovine adattate al buio sono state acquistate e spedite su ghiaccio (vedi Tabella dei materiali). Da queste retine, le OS sono state purificate seguendo un protocollo23 precedentemente pubblicato.

  1. Reticolazione del segmento esterno con una lampada UV
    1. Immergere completamente i vetrini rivestiti in politetrafluoroetilene (vedi Tabella dei materiali) in etanolo al 70% per 10 minuti in un armadio di biosicurezza per sterilizzare i vetrini. Lasciare asciugare i vetrini all'aria in una capsula di coltura cellulare sterile da 100 mm.
    2. Collocare ciascun vetrino in un nuovo piatto di coltura cellulare da 100 mm e aggiungere 200 μL di terreno di coltura cellulare contenente siero (qualunque sia il mezzo tipicamente utilizzato per le colture RPE in questione) in ciascun rettangolo, quindi posizionare una luce UV portatile da 254 nm (vedi tabella dei materiali) sul piatto di coltura cellulare da 100 mm (senza coperchio) con bulbo rivolto direttamente verso il vetrino, ed esporre per 20 min. I supporti specificamente utilizzati per questo studio e i numeri di prodotto specifici per i componenti del supporto sono stati precedentemente pubblicati22,23. Questo supporto è definito "supporto RPE" in tutto questo protocollo.
      NOTA: il trattamento UV dei supporti blocca la superficie del vetro e impedisce al sistema operativo di attaccarsi durante le fasi successive.
    3. Scongelare aliquote congelate di OS a 37 °C (in mano o a bagnomaria). La quantità di sistema operativo necessaria dipende dall'applicazione. In generale, si possono trattare fino a 500 μL di 2 x 108 OS/mL per rettangolo sul vetrino.
    4. Una volta scongelato, ruotare il sistema operativo a 2400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare immediatamente il surnatante nell'armadio di biosicurezza utilizzando una pipetta anziché un vuoto per evitare la perdita accidentale del pellet.
    5. Risospendere delicatamente il pellet con PBS sterile.
      NOTA: tenere traccia del volume risospeso e della concentrazione prevista. ad esempio, risospendendo il pellet da un tubo da 1 mL di 1 x 10 8 OS/mL con 500 μL di PBS si ottengono 2 x 108 OS/mL. Il volume e la concentrazione massimi per rettangolo sul vetrino rivestito di politetrafluoroetilene sono 500 μL di 2 x 108 OS/ml.
    6. Aspirare il supporto dai vetrini e posizionare fino a 500 μL di 2 x 108 OS/mL di soluzione PBS su ciascun rettangolo del vetrino. Posizionare la luce UV portatile sul piatto di coltura cellulare (senza coperchio) con la lampadina direttamente rivolta verso il sistema operativo. Esporre la soluzione del sistema operativo alla luce a 254 nm per 40 minuti.
      NOTA: Durante l'esposizione di 40 minuti, coprire la lampada UV e il piatto con un asciugamano o un tampone assorbente, chiudere l'anta dell'armadio di biosicurezza e spegnere il ventilatore. Ciò impedirà che si verifichi un'evaporazione significativa. Se la lampada UV utilizzata in questo protocollo non è disponibile per un ricercatore, ci sono due alternative per garantire la quantità appropriata di reticolazione è raggiunta. Il primo è quello di seguire l'esposizione UV quantitativa descritta nel punto 1.2, sia con il dispositivo descritto nel punto 1.2 o un altro dispositivo in grado di fornire la stessa esposizione radiante quantitativa di detto dispositivo in 1.2. Un'altra alternativa è quella di esporre OS all'irradiazione UV per un tempo che induca il grado di reticolazione sulla colorazione di Coomassie visto nella Figura 1C.
    7. Raccogliere la soluzione di OS PBS trattata in provette sterili per microcentrifuga, rilavando il rettangolo del vetrino rivestito con 200-500 μL di PBS (2-3x) e raccogliendo ogni lavaggio nella provetta della microcentrifuga. Una volta fatto, guarda il vetrino sotto un microscopio da sala di coltura tissutale per confermare che quasi tutti i sistemi operativi sono stati rimossi dal vetrino.
    8. Ruotare la soluzione OS PBS a 2400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare il PBS nell'armadio di biosicurezza con un pipettor e risospendere in un supporto standard da 500 μL che verrà utilizzato per le colture RPE (ad esempio "media RPE" definito nella sezione 1.1.2). Il volume di risospensione può essere regolato in base alla concentrazione desiderata di OS foto-ossidato (OxOS).
    9. Posizionare 10 μL della sospensione in una nuova provetta per microcentrifuga, diluire 50-100x con più terreni di coltura cellulare e contare gli OS con un emocitometro.
    10. In base al numero di sistemi operativi, diluire la sospensione OxOS fino a una concentrazione finale delle scorte. Per l'alimentazione di colture RPE altamente mature in Transwell a 24 pozzetti (area superficiale di 0,33 cm 2; vedi Tabella dei materiali), si raccomanda una concentrazione finale del terreno di coltura di2 x 107 OS/mL.
      1. Per ottenere ciò, distribuire OxOS in aliquote da 25 μL a una concentrazione di 5,6 x 107 OS/ml, sospesa in terreni di coltura RPE standard. Dopo aver scongelato un'aliquota da 25 μL, mescolare l'intera aliquota con 45 μL di terreno di coltura RPE standard, fornendo un volume finale del supporto di 70 μL e una concentrazione di OS di 2 x 107 OS/mL per ogni alimentazione OxOS Transwell.
    11. Prima di aliquotare l'OxOS, aggiungere ligandi ponte per la fagocitosi (Proteina S e MFG-E8, vedere Tabella dei materiali), che facilitano l'assorbimento di OS e l'accumulo di lipofuscina. Le concentrazioni operative di ligandi ponte in un Transwell a 24 pozzetti sono 4 μg/ml per la proteina S purificata umana e 1,5 μg/ml per l'MFG-E8 ricombinante umano. Pertanto, per 25 μL di aliquote di OxOS a 5,6 x 107 OS/ml, la concentrazione di riserva per la proteina S è di 11,2 μg/ml e per MFG-E8 è di 4,2 μg/ml.
      NOTA: Le concentrazioni di leganti ponte sono state ottimizzate per colture hfRPE su Transwell a 24 pozzetti, con un conteggio approssimativo delle cellule di 320.000 cellule per pozzetto da 0,33 cm2 . Potrebbe essere necessario aggiustare le concentrazioni di ligando per altri tipi di RPE e densità cellulari poiché i ligandi presenti in eccesso rispetto alla disponibilità del recettore della fagocitosi possono paradossalmente bloccare l'assorbimento di OS28.
    12. Congelare le aliquote in azoto liquido.
      NOTA: i congelamenti multipli sono altamente dannosi per l'integrità del sistema operativo.
  2. Cross-linking del segmento esterno con un dispositivo reticolante UV
    NOTA: seguire il passaggio 1.1, ad eccezione dei passaggi seguenti, che sostituiscono rispettivamente i passaggi 1.1.2 e 1.1.6:
    1. (sostituisce il punto 1.1.2) Posizionare ogni vetrino in un nuovo piatto di coltura cellulare da 100 mm e aggiungere 200 μL di terreno di coltura cellulare contenente siero (ad esempio -"RPE media" o qualsiasi altro sostituto) in ciascun rettangolo, quindi posizionare i vetrini in un dispositivo reticolante ultravioletto (vedere Tabella dei materiali), trattando con UV a 254 nm con un'esposizione radiante di 3-6 J / cm2 per bloccare la superficie del vetro e impedire che il sistema operativo si attacchi durante i passaggi successivi.
    2. (sostituisce il passaggio 1.1.6) Aspirare il supporto dai vetrini e posizionare fino a 500 μL di 2 x 108 OS/mL in PBS sterile su ciascun rettangolo del vetrino. Posizionare i vetrini nel dispositivo Ultraviolet Crosslinker, impostare l'esposizione radiante del trattamento secondo necessità (3-9 J / cm2) e trattare a 254 nm.
      NOTA: L'esposizione radiante necessaria può essere determinata con attenzione titolando l'esposizione radiante tra 3-9 J/cm2 fino al raggiungimento del grado di autofluorescenza e del cross-linking proteico (come si vede in Figura 1B e Figura 1C).
      ATTENZIONE: la manipolazione del sistema operativo all'esterno di un armadio di biosicurezza può causare contaminazione. Dopo l'esposizione di OS al dispositivo UV Crosslinker, raccogliere OS con punte di pipette sterili, trasferirlo in tubi sterili per microcentrifuga e gestire tutti gli ulteriori passaggi nella cappa di biosicurezza.
  3. Caratterizzazione del sistema operativo ossidato
    1. Quantificare lo spettro di emissione di autofluorescenza mediante imaging
      1. Introdurre 20-50 μL di soluzione madre da OS non trattata e OxOS in due provette di microcentrifuga separate. Centrifugare a 2400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, risospendere il pellet in paraformaldeide tamponata (ad esempio PBS) al 4% e fissare per 15 minuti a temperatura ambiente.
      2. Dopo la fissazione, girare verso il basso come sopra, lavare con PBS x 2 (girare tra un lavaggio e l'altro), quindi risospendere in meno di 30 μL di PBS.
      3. Posizionare alcuni microlitri della risospensione su un vetrino da microscopio, aggiungere il supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali) e infine un coprifoglio.
      4. Immagine OxOS su un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali).
        NOTA: l'autofluorescenza OxOS può essere eccitata da un'ampia gamma di lunghezze d'onda laser, ma in genere viene utilizzata una linea laser a 405 nm o 488 nm. L'emissione è altrettanto ampia, ma una tipica configurazione del filtro di eccitazione/emissione GFP/FITC è adeguata per visualizzare l'autofluorescenza.
      5. Per misurare lo spettro di emissione OxOS, utilizzare la scansione λ su un microscopio confocale. Le tipiche impostazioni di scansione λ includono l'eccitazione con 405 nm o 488 nm e il rilevamento di emissioni che vanno da 10 nm spostate verso il rosso dalla linea di eccitazione laser fino a circa 800 nm, con una dimensione del passo λ di 10 nm. Ogni sistema di microscopia ha le sue indicazioni su come utilizzare la modalità λ e il lettore deve fare riferimento al manuale per la loro specifica confocale.
    2. In alternativa, quantificare l'autofluorescenza mediante citometria a flusso.
      1. Centrifugare 2 x 10 7 OS non trattati e separatamente 2 x 107 OxOS in provette da microcentrifuga e risospendere in 1 mL di PBS.
        NOTA: La fissazione non è richiesta se la citometria a flusso viene eseguita direttamente dopo lo scongelamento.
      2. Caricare campioni di OS e OxOS non trattati su citometri a flusso (vedere Tabella dei materiali). Regolare la dispersione diretta (FSC) e la dispersione laterale (SSC) su una diffusione accettabile nel grafico a dispersione FSC-SSC. Utilizzare PBS come controllo per escludere qualsiasi piccola particella contaminante. Si noti che i sistemi operativi sono considerevolmente più piccoli delle celle.
      3. Utilizzare il canale FITC standard del citometro a flusso per la quantificazione dell'autofluorescenza. Conta almeno 10.000 eventi. Utilizzare il valore dell'area dell'impulso dell'istogramma FITC per rappresentare l'intensità della fluorescenza.
        NOTA: Per il presente studio, tutti i dati vengono analizzati utilizzando il software di analisi del citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Valutare il grado di reticolazione in OxOS
      1. Centrifugare 2 x 10 7 OS non trattati e separatamente 2 x 107 OxOS in provette per microcentrifuga. Rimuovere il surnatante e lisare direttamente il pellet aggiungendo 1,2x Laemmli Sample Buffer (sufficiente a coprire; vedere Tabella dei materiali). Vortice, tenere a temperatura ambiente per 30 minuti, centrifugare a temperatura ambiente a uguale o superiore a 12000 x g per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
        NOTA: La valutazione del grado di reticolazione proteica in OxOS dà un'idea dell'adeguatezza del trattamento UV. Il confronto viene effettuato tra OS non trattati e OxOS, e un'adeguata reticolazione si verifica quando la banda monomerica di rodopsina che domina la colorazione di Coomassie (Figura 1C, freccia) è appena percettibile, con l'emergere di aggregati di ordine superiore e uno striscio proteico nella parte superiore del gel.
        ATTENZIONE: Quando si utilizza il buffer di campionamento per lisare il sistema operativo, non riscaldare successivamente la soluzione di lisi, poiché ciò può innescare l'aggregazione della rodopsina. Evitare inoltre di raffreddare il sistema operativo lisato fino a quando non è pronto per l'archiviazione, poiché ciò accelererà SDS. I lisati non utilizzati possono essere mantenuti a -20 °C. In caso di scongelamento, assicurarsi che i lisati siano completamente scongelati a temperatura ambiente prima dell'uso.
      2. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando un test proteico tollerante a elevate concentrazioni di SDS e riducenti29. Vedere la Tabella dei materiali per suggerimenti sui reagenti appropriati per il dosaggio delle proteine e seguire il protocollo del produttore per questi reagenti.
      3. Eseguire campioni OS e OxOS non trattati mediante elettroforesi SDS-PAGE30 su un gel gradiente del 4% -15%, utilizzando il tampone SDS tris-glicina standard. Il gel viene eseguito a 80 V fino a quando i campioni entrano nella pila, quindi a 120 V per 50-60 minuti a temperatura ambiente.
      4. Colorare il gel con blu Coomassie utilizzando i protocolli standard31. La colorazione Coomassie dimostrerà l'adeguatezza della reticolazione indotta dal trattamento UV.

2. Costruire granuli simili a lipofuscine (UAM) in colture RPE

  1. Alimentazioni OxOS: quantità, frequenza e leganti ponte fagocitosi
    NOTA: Le poppate avvengono su colture umane iPSC-RPE o hfRPE al passaggio 1, coltivate secondo il protocollo delineato dal laboratorio Bharti (per iPSC-RPE)32 o il nostro protocollo precedentemente delineato per hfRPE, adattato dal laboratorio Sheldon Miller22,23. Tutti i calcoli riportati di seguito si basano sull'alimentazione di OxOS o OS a un Transwell a 24 pozzetti (diametro 6,5 mm, area di crescita 0,33 cm2).
    1. Scongelare 25 μL di 5,6 x 107 OxOS/mL a 37 °C e aggiungere 45 μL di terreno di coltura cellulare all'aliquota OxOS, ottenendo un volume finale di 70 μL.
      NOTA: Le aliquote OxOS preparate nella fase 1 conterranno ligandi ponte per fagocitosi MFG-E8 e Proteina S. Tuttavia, se tali ligandi non sono stati aggiunti alle aliquote prima del congelamento, possono essere aggiunti in questa fase, garantendo che la concentrazione finale dei ligandi nei mezzi da alimentare con le cellule sia di 4 μg/ml per la proteina S e di 1,5 μg/ml per MFG-E8. Come indicato nella fase 1.1.11, può essere necessario modificare le concentrazioni di ligandi ponte per altri tipi di RPE o densità cellulari.
    2. Rimuovere il mezzo apicale da Transwell e aggiungere 70 μL di 2 x 107 OxOS/mL con i ligandi che collegano la fagocitosi alla camera apicale. Dopo 24 ore, rimuovere e sostituire con una nuova alimentazione OxOS. L'alimentazione avviene ogni giorno durante i giorni feriali, saltando i fine settimana, fino al completamento di 20 poppate (~ 1 mese). Cambiare terreno di coltura cellulare basolaterale (400-550 μL) 2-3 volte a settimana.
    3. Al completamento di 20 poppate, riprendere i normali cambi di terreno per il pozzo.
      NOTA: Sono necessari diversi cambi di supporto aggiuntivi per lavare via OxOS appiccicoso dalla superficie apicale RPE, quindi gli esperimenti con le colture cariche di UAM devono essere eseguiti almeno 1-2 settimane dopo la conclusione dell'alimentazione OxOS.
      ATTENZIONE: È importante disporre di controlli adeguati per l'accumulo di UAM tramite alimentazioni OxOS. Poiché i cambiamenti giornalieri dei mezzi possono influenzare la biologia dell'RPE, si raccomandano i seguenti pozzetti di controllo: Controllo 1: sostituire i media ogni giorno durante i giorni feriali per lo stesso numero di poppate del gruppo trattato con OxOS. Controllo 2: Alimentare quotidianamente l'OS RPE non trattato durante i giorni feriali alla stessa concentrazione e volume delle poppate OxOS, per lo stesso numero di poppate.
  2. Monitoraggio della salute delle colture cariche di granuli simili a lipofuscine mediante test di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e morte cellulare
    NOTA: Durante e dopo l'alimentazione di OxOS, la salute delle colture RPE può essere misurata valutando l'integrità della giunzione stretta RPE e la morte cellulare. È stato precedentemente dimostrato che la valutazione dell'integrità della giunzione stretta, attraverso la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER), è un marcatore sensibile per la salute generale delle cellule33. Possono essere impiegati anche marcatori non invasivi più tradizionali di morte cellulare, come il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH).
    1. Esegui TEER
      NOTA: TEER è testato con un misuratore di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e un elettrodo TEER, generalmente seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
      1. Per sterilizzare l'elettrodo TEER, utilizzare un tergicristallo imbevuto di etanolo al 70% per pulire l'elettrodo e quindi immergere le punte della sonda dell'elettrodo in etanolo al 70% per 10 minuti.
      2. Lasciare asciugare completamente l'elettrodo, quindi immergere l'elettrodo in mezzi sterili.
      3. Rimuovere la sonda dai mezzi sterili e inserire le due sonde dell'elettrodo TEER nelle camere apicali e basolaterali di un Transwell in coltura; La punta della sonda più lunga si inserisce nella camera basolaterale.
        NOTA: È facile raschiare il fondo della camera apicale con l'elettrodo TEER senza pratica, e tale raschiatura altererà drasticamente le letture TEER quando il monostrato RPE confluente viene interrotto. Pertanto, si raccomanda ai principianti di esercitarsi su Transwell non importanti prima di testare su colture RPE sperimentali. Inoltre, dopo che ogni piastra di colture RPE è stata testata, lo sperimentatore dovrebbe verificare eventuali raschiature del monostrato RPE sotto un microscopio di coltura tissutale standard.
      4. Una volta che le sonde apicali e basolaterali sono in posizione nel Transwell, premere il pulsante di lettura o premere l'interruttore a pedale del misuratore per registrare il TEER. Tra piastre o gruppi di celle, lavare la sonda dell'elettrodo con mezzi sterili. Se l'infezione è una preoccupazione elevata, risterilizzare tra le piastre.
      5. Calcolare TEER prendendo la lettura della resistenza dal misuratore, sottraendo il valore di un Transwell vuoto con il mezzo ma senza celle (generalmente 100-110 Ω per un Transwell a 24 pozzetti con 0,33 cm2 di superficie), e quindi moltiplicando per l'area superficiale del Transwell.
        NOTA: i valori TEER devono essere riportati normalizzati alla superficie della cella. I valori tipici per colture hfRPE sane vanno da 350-1100 Ωcm2. I valori di TEER aumentano al diminuire della temperatura. Pertanto, quando si spostano colture da un'incubatrice a 37 °C in una cappa a temperatura ambiente, i valori di TEER tenderanno ad aumentare su tutta la piastra. Per proteggersi da questa variabilità, lavorare rapidamente (se sperimentato) o attendere 10-15 minuti affinché la temperatura della piastra si equilibri con la temperatura ambiente.
    2. Eseguire il test di rilascio LDH
      NOTA: Il rilascio di LDH in coltura cellulare surnatante avviene durante la morte cellulare e deve essere misurato con un kit standard (vedere Tabella dei materiali).
      1. Raccogliere il surnatante da sopra le cellule dopo un'incubazione di 24 ore e diluire a 1:100 utilizzando mezzi standard.
      2. Indurre il possibile rilascio totale di LDH, che è importante per normalizzare tutti i valori dal punto 2.2.2.1, aggiungendo 2 μL 10% tritone X-100 ai 100 μL di mezzi apicali da cellule di controllo in un Transwell a 24 pozzetti. Dopo aver incubato la miscela di surnatante tritone/cellula per 15 minuti a 37 °C, mescolare il mezzo sopra le cellule ora lisate e raccogliere per misurare il possibile rilascio totale di LDH.
      3. Una volta raccolti i surnacenti, eseguire il test utilizzando le istruzioni standard del produttore, misurando la luminescenza dopo un'incubazione di 30 minuti utilizzando la soluzione tampone del kit.
        NOTA: tutti i valori LDH sono normalizzati alla quantità totale possibile di rilascio di LDH.
  3. Caratterizzazione dello spettro e della composizione dei granuli lipofuscina-simili
    1. Acquisizione della quantificazione e degli spettri di autofluorescenza
      1. Fissare le colture cariche di UAM con il 4% di PFA a temperatura ambiente per 15 minuti, seguite da un lavaggio PBS 5x.
      2. Tenere una piccola quantità di PBS nella camera apicale e quindi capovolgere il Transwell. Utilizzando un microscopio da dissezione e una lama di rasoio, tagliare la membrana semiporosa dal Transwell, applicando forza di taglio alla giunzione della membrana e Transwell.
        NOTA: Mantieni la coerenza su quanto vicino al labbro del Transwell viene effettuato il taglio, poiché la membrana Transwell ha la tendenza a deformarsi e raggrinzire quando i tagli non sono coerenti.
      3. Una volta tagliata la membrana Transwell, posizionarla immediatamente su un vetrino da microscopio usando una pinza, facendo attenzione ad evitare di toccare parti della membrana Transwell con le cellule. Elimina il PBS in eccesso con una pulizia delle attività, evitando di toccare le cellule. Aggiungere un supporto di montaggio e una copertina. Assicurati di tenere traccia di quale lato del Transwell è "lato destro verso l'alto" quando copri il Transwell.
      4. Acquisire l'intensità e gli spettri autofluorescenti utilizzando le stesse impostazioni e procedure del punto 1.3.1.4 e del punto 1.3.1.5.
        NOTA: Durante l'imaging UAM, un importante fattore confondente è che gli OxOS sono autofluorescenti e spesso si attaccano alla superficie apicale RPE per giorni e talvolta anche settimane dopo il completamento dell'alimentazione di OxOS. Di conseguenza, quando si quantifica l'UAM, è necessario utilizzare un metodo per garantire che l'autofluorescenza misurata provenga da UAM e non da OxOS. Il metodo più semplice è quello di co-colorare le colture di lipofuscina con un anticorpo rodopsina. Ad esempio, l'anticorpo anti-rodopsina 4D2 può essere utilizzato a una diluizione 1:1000 e con un protocollo immunocitochimico standard di fissazione PFA34. L'anticorpo secondario per la rodopsina dovrebbe essere un anticorpo coniugato con colorante rosso lontano (ad esempio con un massimo di eccitazione vicino a 647 nm), poiché l'autofluorescenza UAM e OxOS tende ad essere più debole in questa lunghezza d'onda. Le immagini confocali possono quindi essere acquisite sequenzialmente in due canali, eccitando l'autofluorescenza UAM e OxOS con un laser a 405 nm ed emissione da 415 nm a 550 nm, mentre la rodopsina residua, che indica OxOS non digerito, può essere eccitata con parametri standard di imaging del colorante rosso lontano in un canale separato. Dopo l'acquisizione, il canale della rodopsina può essere utilizzato come maschera sottrattiva in un programma come ImageJ per rimuovere l'autofluorescenza proveniente da OxOS rimanenti appiccicosi, lasciando dietro di sé solo l'autofluorescenza UAM da quantificare.
        ATTENZIONE: Anche i sistemi operativi che non sono foto-ossidati mostrano una certa autofluorescenza e, anche con un lavaggio rigoroso, alcuni OS e OxOS aderiscono alla superficie RPE. Pertanto, senza generare una maschera sottrattiva utilizzando l'immunocolorazione della rodopsina, come suggerito nella NOTA precedente, non è possibile quantificare accuratamente i livelli di autofluorescenza UAM in colture alimentate con OxO o OS standard.
    2. Eseguire il rilevamento simultaneo di granuli simili a lipofuscina e altri marcatori di immunofluorescenza
      NOTA: Come descritto nel punto 2.3.1, l'ampio spettro di autofluorescenza della lipofuscina limita le scelte per la co-colorazione della fluorescenza. I seguenti metodi possono essere considerati per facilitare la co-colorazione.
      1. Utilizzare un fluoroforo rosso lontano. L'autofluorescenza da lipofuscina è debole nel vicino infrarosso. Pertanto, l'utilizzo di un colorante rosso lontano per il rilevamento della fluorescenza di un antigene di interesse, combinato con un'attenta regolazione delle impostazioni del canale su un microscopio confocale, di solito può distinguere l'autofluorescenza dalla fluorescenza co-colorante.
      2. Approfitta della lunga coda di emissione di fluorescenza della lipofuscina.
        NOTA: Poiché la lipofuscina ha uno spettro di emissione di fluorescenza molto ampio, può spesso essere eccitata a una lunghezza d'onda a bassa nm (ad esempio laser 405 nm) e avere emissioni ancora rilevate nella porzione arancione / rossa dello spettro (ad esempio 585-635nm). Questa combinazione unica di lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione può spesso essere adattata attorno a un altro fluoroforo co-colorante.
        1. Rilevare l'antigene di interesse utilizzando un fluoroforo che ha un picco di eccitazione intorno a 488 nm, con rilevamento dell'emissione a 500-530 nm. Impostare un canale separato per il rilevamento di autofluorescenza con eccitazione a 405 nm ed emissione 585-635 nm. Questo secondo canale rileverà solo UAM, mentre il primo canale rileverà l'antigene di interesse più lipofuscina.
        2. Utilizzando un programma free-ware come ImageJ, utilizzare questo secondo canale solo UAM come maschera sottrattiva per rimuovere il segnale UAM dal primo canale (che contiene sia il segnale dell'antigene che il segnale UAM).
      3. Utilizza la dismiscelazione spettrale. La maggior parte dei moderni microscopi confocali contiene un'opzione di dismiscelazione spettrale. Ciò consente di acquisire lo spettro di un campione con solo UAM e un altro campione con solo il fluoroforo co-colorante di interesse. Il campione sperimentale, che contiene sia UAM che il fluoroforo co-colorante, può quindi essere acquisito e sottoposto a metodi di non miscelazione lineare per calcolare quale percentuale del segnale provenga dall'autofluorescenza rispetto alla co-colorazione.
        NOTA: Guide complete alla miscelazione spettrale sono disponibili con la maggior parte dei moderni microscopi confocali.
      4. Utilizzare l'imaging a fluorescenza. Mentre lo spettro di emissione tra UAM e un fluoroforo co-colorante di interesse può essere simile, è probabile che la loro durata di fluorescenza differisca significativamente. In generale, l'UAM dimostra una durata di fluorescenza più breve rispetto alla maggior parte dei fluorofori specifici. Con l'accesso a un microscopio confocale che consente l'imaging a vita, è possibile bloccare i segnali di fluorescenza per rilevare quelli che sono più lunghi della tipica durata della lipofuscina.
        NOTA: In generale, la durata della fluorescenza di gating a segnali più lunghi di 2 ns riduce notevolmente la contaminazione UAM, sebbene non elimini completamente il segnale.
      5. Utilizzo di un soppressore di autofluorescenza. Tradizionalmente, Sudan Black è stato usato per estinguere l'autofluorescenza prima della colorazione specifica con immunofluorescenza35. Diversi prodotti di tempra ad autofluorescenza disponibili in commercio riferiscono di migliorare i risultati di Sudan Black e questi prodotti sono dettagliati nella tabella dei materiali. La tempra ad autofluorescenza, ovviamente, distruggerà la capacità di rilevare la lipofuscina.
    3. Determinare la composizione dei granuli simili alla lipofuscina
      1. Valutare i lipidi neutri
        1. Fissare RPE carico di UAM e controllare i pozzetti (alimentati con sistema operativo non trattato) in PFA al 4% a temperatura ambiente per 15 minuti e lavare con PBS 5x.
        2. Colorare per lipidi neutri utilizzando 10 μg/mL Nile Red o 3,33 μg/mL Bodipy 493/503 in una soluzione di BSA PBS al 3% a temperatura ambiente per 1 ora, seguito da lavaggio con PBS per 5 min 3x.
        3. Ritagliare e montare Transwell come nei passaggi 2.3.1.2 e 2.3.1.3 e nell'immagine. In generale, utilizzare le seguenti larghezze di banda di eccitazione ed emissione per l'imaging: Nilo Red - ex 543 nm, em 620-700 nm e Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Valutare il colesterolo esterificato e non esterificato
        1. Seguire il passaggio 2.3.3.1.1
        2. La filippina è un colorante fluorescente che riconosce il colesterolo non esterificato, ma non il colesterolo esterificato36. Pertanto, per valutare la quantità di colesterolo totale (non esterificato ed esterificato) nell'UAM, prima pre-trattare il campione con esterasi di colesterolo per convertire il colesterolo esterificato in colesterolo non esterificato. Trattare le cellule con 20 U/mL di colesterolo esterasi in tampone fosfato di potassio 0,1 M (pH 7,2) (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C per 3,5 ore, quindi lavare con PBS per 5 minuti 3x.
        3. Colorare con 50 μg/mL di filipina (vedere Tabella dei materiali) in PBS a temperatura ambiente per 1 ora e lavare con PBS per 5 min 3x. Tenere i campioni coperti, lontano dalla luce, poiché la filipin photobleachings facilmente.
          NOTA: Se si deve quantificare solo il colesterolo non esterificato, la colesterolo esterasi nel punto 2.3.3.2.2 può essere saltata. Se la quantità di colesterolo esterificato deve essere quantificata, può essere dedotta dalla differenza tra il colesterolo totale e il colesterolo non esterificato nel campione.
        4. Ritagliare e montare Transwell come nei passaggi 2.3.1.2 e 2.3.1.3 e l'immagine.
          NOTA: Quando si esegue l'imaging filippino, fotosbianca molto rapidamente. È necessario ridurre al minimo l'intensità e la durata dell'eccitazione e aspettarsi che si verifichi un po 'di fotosbiancamento anche con la visualizzazione del campione attraverso gli oculari. Pertanto, durante l'imaging, si dovrebbe: (1) cercare un'area appropriata per l'immagine utilizzando un canale di fluorescenza diverso dal canale filipina, (2) filipin immagine su un microscopio a campo largo piuttosto che confocale (per limitare l'intensità dell'esposizione alla luce) e (3) evitare l'imaging ripetuto di un'area. In generale, utilizzare le seguenti larghezze di banda di eccitazione ed emissione per l'imaging filipin - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Valutazione degli effetti dei granuli simili alla lipofuscina sulla fagocitosi RPE: capacità di consumo totale

NOTA: Il razionale per misurare la fagocitosi OS tramite il protocollo solo impulso OS riportato di seguito è dettagliato nella sezione dei risultati rappresentativi. Il metodo, che è definito "Capacità di consumo totale", evita ambiguità sull'efficienza della fagocitosi che possono emergere con i tradizionali saggi di fagocitosi a inseguimento di impulsi OS. I saggi vengono eseguiti su piastre Transwell a 24 pozzetti utilizzando 50 μL di terreno contenente 4 x 106 OS/mL.

  1. Calcolare il numero di pozzetti necessari per l'esperimento e quindi scongelare una quantità appropriata di OS regolare, ruotare a 2400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e risospendere in terreni di coltura cellulare RPE standard a 4 x 106 OS / mL. Aggiungi ligandi ponte per facilitare i tassi di fagocitosi.
    NOTA: La concentrazione finale dei ligandi ponte nei mezzi da alimentare con le cellule è di 4 μg/mL per la proteina S e di 1,5 μg/mL per l'MFG-E8. Come indicato nella fase 1.1.11, può essere necessario modificare le concentrazioni di ligandi ponte per altri tipi di RPE o densità cellulari.
  2. Rimuovere i mezzi apicali e aggiungere 50 μL 4 x 106 OS/mL, idealmente con concentrazioni appropriate di leganti a ponte.
  3. In vari momenti dopo l'aggiunta di OS (ad esempio - 0 h, 1 h, 4 h e 24 h), aggiungere 16,67 μL 4x tampone campione Laemmli con inibitori della proteasi per lisare entrambe le cellule e il sovrastante surnatante contenente OS. Utilizzare una pipetta P-200 per graffiare la superficie di Transwell, facendo attenzione a non perforare la membrana Transwell o staccare la membrana dalla Transwell e raccogliere insieme il surnatante cellulare combinato più lisato cellulare. Vortice, girare verso il basso e lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti per una completa denaturazione.
    ATTENZIONE: Nonostante l'utilizzo del buffer di campionamento per lisare il sistema operativo, non riscaldare successivamente la soluzione di lisi, poiché ciò può innescare l'aggregazione della rodopsina. Evitare anche di raffreddare il sistema operativo lisato fino al momento della conservazione, poiché ciò farà precipitare le proteine. Congelare i lisati non utilizzati a -20 °C, assicurandosi che i lisati siano completamente scongelati prima dell'uso.
  4. Eseguire lisati su SDS PAGE utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 1.3.3, caricando volumi uguali di lisati per pozzetto. GAPDH, β-actina o un'altra proteina housekeeping dovrebbero essere usati per normalizzare il numero di cellule, poiché i tassi di fagocitosi dipendono dal numero di cellule.
  5. Sonda Western blots con anticorpi contro il N- o C- terminale della rodopsina. Utilizzare le condizioni standard di Western blotting e le diluizioni anticorpali sono elencate nella tabella dei materiali.
    NOTA: Sotto la banda principale di rodopsina, ci saranno più frammenti di rodopsina. Questi frammenti rappresentano rodopsina parzialmente digerita, un processo che inizia prima della fusione del fagosoma con il lisosoma32,33. Un aumento del numero di frammenti di rodopsina nell'RPE carico di UAM rispetto all'RPE di controllo potrebbe indicare un difetto a valle nella capacità del fagolisosoma, a livello di fusione fagosoma-lisosoma, acidificazione lisosomiale e/o funzione enzimatica degradativa 16,34,35.

Risultati

Il set-up per la foto-ossidazione del sistema operativo è illustrato nella Figura 1Ai. Le guide rivestite in politetrafluoroetilene consentono di caricare un grande volume di OS in soluzione per rettangolo aperto senza diffondersi sul resto del vetrino. Il vetrino con OS è contenuto all'interno di una capsula di Petri sterile con il coperchio spento e una lampada UV è posizionata sopra la diapositiva come mostrato in Figura 1Aii. In alternativa, il vetrino pu...

Discussione

Mentre RPE lipofuscin è stato studiato per decenni, la sua tossicità è dibattuta 2,9,16,42. Data l'ambiguità sulla tossicità della lipofuscina da modelli animali11, i modelli in vitro che utilizzano RPE umano sono preziosi. È stata descritta una serie di modelli di accumulo di lipofuscina in vitro, ma nessuno ha utilizzato sia l'alimentazione OS c...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato, in parte, da sovvenzioni della Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) e International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. è attualmente supportato da una sovvenzione K08 del National Eye Institute (EY033420). Nessun fondo federale è stato utilizzato per la ricerca HFT. Un ulteriore sostegno viene dalla James Grosfeld Initiative for Dry AMD e dai seguenti donatori privati: Barbara Dunn e Dee & Dickson Brown.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

Riferimenti

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