高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

要約

このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。

要約

網膜色素上皮(RPE)による視細胞外側セグメントの毎日の食作用は、リポフスチンと呼ばれる細胞内老化色素の蓄積に寄与する。リポフスチンの毒性は、最も一般的な遺伝性網膜変性症であるスターガルト病で十分に確立されていますが、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)ではより物議を醸しています。ヒトにおけるリポフスチン毒性を決定することは困難であり、Stargardtの動物モデルは毒性が限られている。したがって、in vivoでヒトRPEを模倣するin vitroモデルは、リポフスチンの生成、クリアランス、および毒性をよりよく理解するために必要です。これまでの細胞培養リポフスチンモデルの大部分は、細胞株内にあったか、またはRPEに光受容体外周セグメント全体の断片/先端ではなく、複雑なリポフスチン混合物の単一成分を供給し、より完全で生理学的なリポフスチンモデルを生成します。ここに記載されているのは、高度に分化した初代ヒト出生前RPE(hfRPE)および人工多能性幹細胞(iPSC)由来RPEにおいてリポフスチン様物質(難消化性自己蛍光物質、またはUAMと呼ばれる)の蓄積を誘導する方法である。UAMは、RPEが取り込んだ紫外線処理されたOSフラグメントを食作用によって繰り返し摂食することにより、培養物に蓄積されました。UAMがin vivoでリポフスチンに近似し、異なる主な方法についても説明します。リポフスチン様蓄積のこのモデルに伴い、UAM顆粒の広範な自家蛍光スペクトルを同時抗体染色と区別するためのイメージング方法が導入されています。最後に、RPE食作用能力に対するUAMの影響を評価するために、外側セグメントの断片/ヒントの取り込みと分解を定量化するための新しい方法が導入されました。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来の外部セグメント「パルスチェイス」アッセイに固有のRPE食作用能力の潜在的な誤解を克服します。ここで紹介するモデルと技術は、リポフスチンの生成とクリアランス経路、および推定毒性を研究するために使用できます。

概要

網膜色素上皮(RPE)は、感光体の外側セグメントの先端または断片の毎日の取り込みおよび分解を含む、上にある光受容体に対する重要なサポートを提供する(このプロトコル全体を通して、略語OSは、外側セグメント全体ではなくOSの先端または断片を表す)。有糸分裂後のRPEにおけるこの毎日の取り込みは、最終的に食性ソソーム能力を過負荷にし、リポフスチンと呼ばれる難消化性の自己蛍光性細胞内物質の蓄積につながります。興味深いことに、いくつかの研究はまた、RPEリポフスチンがOS貪食なしに蓄積できることを実証しています^1,2。リポフスチンは、視覚周期レチノイドに由来する架橋付加物を含む多くの成分を有しており、80歳以上のRPE細胞体積のほぼ20%を占めることができる³。

リポフスチンが有毒であるかどうかは熱く議論されています。スターガルト病は、光受容体とRPEの常染色体劣性変性であり、ABCA4の変異が光受容体の外側セグメントに含まれる視覚周期レチノイドの不適切な処理を引き起こします。不適切なレチノイド処理は、異常な架橋と、ビス-レチノイドN-レチニリデン-N-レチニルエタノールアミン(A2E)を含むビス-レチノイド種の形成につながります。研究は、A2E毒性の複数のメカニズムを示しています

プロトコル

ヒト組織の取得と使用を含む本プロトコルは、ミシガン大学治験審査委員会(HUM00105486)によってレビューおよび承認されました。

1. 光酸化アウターセグメントチップおよびフラグメントの調製

注:暗順応したウシ網膜を購入し、氷上で出荷しました( 材料の表を参照)。これらの網膜から、OSは、以前に公開されたプロトコル²³に従って精製された。

1. UVランプによるアウターセグメント架橋
   1. ポリテトラフルオロエチレンでコーティングされたスライド( 材料の表を参照)を70%エタノールに完全に浸し、バイオセーフティキャビネットに10分間浸して、スライドを滅菌します。スライドを滅菌済みの100 mm細胞培養皿で風乾します。
   2. 各スライドを1つの新しい100 mm細胞培養皿に入れ、200 μLの血清含有細胞培養培地(手元のRPE培養に通常使用される培地)を各長方形に追加し、次にハンドヘルド254 nmUV光(材料の表を参照)をバルブをスライドに直接向けた100 mm細胞培養皿(蓋なし)に置きます。 そして20分間露光します。この研究に特に使用された培地および培地の構成要素の特定の製品番号は、以前に公開されている

ディスカッション

RPEリポフスチンは何十年にもわたって研究されてきましたが、その毒性は議論されています^2,9,16,42。動物モデル¹¹からのリポフスチンの毒性についての曖昧さを考えると、ヒトRPEを用いたin vitroモデルは貴重です。さまざまなin vitroリポフスチン蓄積モデルが記載さ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000