Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

요약

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

초록

망막 색소 상피(RPE)에 의한 광수용체 외부 세그먼트의 일일 식균 작용은 리포푸신(lipofuscin)이라고 하는 세포 내 노화 색소의 축적에 기여합니다. 리포푸신의 독성은 가장 흔한 유전성 망막변성인 스타가르트병에서 잘 알려져 있지만, 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)에서 더 논란의 여지가 있습니다. 인간에서 리포푸신 독성을 결정하는 것은 어려웠으며 Stargardt의 동물 모델은 독성이 제한적이었습니다. 따라서 생체 내에서 인간 RPE를 모방하는 시험관 내 모델은 리포푸신 생성, 제거 및 독성을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 현재까지 대부분의 세포 배양 리포푸신 모델은 세포주에 있었거나 전체 광수용체 외부 세그먼트의 단편/팁이 아닌 복합 리포푸신 혼합물의 단일 성분을 RPE에 공급하여 보다 완전하고 생리학적인 리포푸신 모델을 생성했습니다. 여기에 기술된 것은 고도로 분화된 일차 인간 산전 RPE(hfRPE) 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 RPE에서 리포푸신 유사 물질(소화되지 않는 자가형광 물질, 또는 UAM으로 명명됨)의 축적을 유도하는 방법이다. 식균 작용을 통해 RPE에 의해 흡수된 자외선 처리된 OS 단편의 반복 공급에 의해 배양에 축적된 UAM. UAM이 생체 내에서 리포푸신과 유사하고 다른 주요 방법도 논의됩니다. 이 리포푸신 유사 축적 모델과 함께 UAM 과립의 광범위한 자가형광 스펙트럼을 동시 항체 염색과 구별하는 이미징 방법이 도입되었습니다. 마지막으로, RPE 식균 작용 능력에 대한 UAM의 영향을 평가하기 위해 외부 세그먼트 조각/팁 흡수 및 분해를 정량화하는 새로운 방법이 도입되었습니다. "총 소비 용량"이라고 하는 이 방법은 고전적인 외부 세그먼트 "펄스 추적" 분석에 내재된 RPE 식균 작용 용량의 잠재적인 오해를 극복합니다. 여기에 소개된 모델과 기술은 리포푸신 생성 및 제거 경로와 추정 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편의 일일 흡수 및 분해를 포함하여 위에 있는 광수용체에 대한 중요한 지원을 제공합니다(이 프로토콜 전체에서 약어 OS는 전체 외부 세그먼트가 아닌 OS 팁 또는 단편을 나타냄). 유사분열 후 RPE의 이러한 일일 섭취는 결국 포골리소좀 용량에 과부하를 일으키고 리포푸신이라고 하는 소화되지 않는 자가형광 세포 내 물질의 축적으로 이어집니다. 흥미롭게도, 여러 연구에서 RPE 리포푸신이 OS 식균작용 없이 축적될 수 있음이 입증되었습니다 ^1,2. 리포푸신은 시각 주기 레티노이드에서 파생된 가교 부가물을 포함하여 많은 성분을 가지고 있으며 80세 이상의 경우 RPE 세포 부피의 거의 20%를 차지할 수 있습니다³.

리포푸신이 독성이 있는지 여부는 뜨거운 논쟁거리입니다. 스타가르트병은 ABCA4의 돌연변이가 광수용체 외부 세그먼트 내에 포함된 시각 주기 레티노이드의 부적절한 처리를 유발하는 광수용체 및 RPE의 상염색체 열성 변성입니다. 부적절한 레티노이드 처리는 비스-레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)을 포함한 비스-레티노....

프로토콜

인체 조직의 획득 및 사용과 관련된 현재 프로토콜은 University of Michigan Institutional Review Board(HUM00105486)에 의해 검토 및 승인되었습니다.

1. 광산화된 외측 세그먼트 팁 및 단편의 제조

참고: 어둠에 적응한 소 망막은 구입하여 얼음 위에서 배송했습니다( 재료 표 참조). 이들 망막으로부터, OS는 이전에 공개된 프로토콜²³에 따라 정제되었다.

1. UV 램프를 사용한 외부 세그먼트 가교
   1. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드( 재료 표 참조)를 70% 에탄올에 10분 동안 완전히 담그고 생물 안전 캐비닛에 넣어 슬라이드를 살균합니다. 슬라이드를 멸균된 100mm 세포 배양 접시에서 자연 건조시킵니다.
   2. 각 슬라이드를 하나의 새로운 100mm 세포 배양 접시에 넣고 200μL의 혈청 함유 세포 배양 배지(RPE 배양에 일반적으로 사용되는 배지)를 각 직사각형에 추가한 다음 전구가 슬라이드를 직접 향하도록 하여 휴대용 254nm UV 광선(재료 표 참조)을 100mm....

토론

RPE 리포푸신은 수십 년 동안 연구되어 왔지만 그 독성은 2,9,16,42에 대해 논의되고 있습니다. 동물 모델¹¹에서 리포푸신의 독성에 대한 모호성을 감안할 때, 인간 RPE를 사용하는 시험관 내 모델은 가치가 있다. 다양한 시험관 내 리포푸신 축적 모델이 설명되었지만 OS 공?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000