Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Özet

Retinal pigment epiteli (RPE) tarafından fotoreseptör dış segmentlerin günlük fagositozu, lipofussin adı verilen hücre içi yaşlanma pigmentinin birikmesine katkıda bulunur. Lipofusin toksisitesi, en yaygın kalıtsal retinal dejenerasyon olan Stargardt hastalığında iyi bilinmektedir, ancak gelişmiş dünyada geri dönüşümsüz körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD) daha tartışmalıdır. İnsanlarda lipofussin toksisitesini belirlemek zor olmuştur ve Stargardt'ın hayvan modelleri sınırlı toksisiteye sahiptir. Bu nedenle, lipofussin üretimini, klirensini ve toksisitesini daha iyi anlamak için insan RPE'sini in vivo olarak taklit eden in vitro modellere ihtiyaç vardır. Bugüne kadar hücre kültürü lipofussin modellerinin çoğunluğu hücre hatlarındaydı veya RPE'yi tüm fotoreseptör dış segmentinin parçaları / uçları yerine karmaşık lipofuscin karışımının tek bir bileşeni ile beslemeyi içeriyordu, bu da daha eksiksiz ve fizyolojik bir lipofuscin modeli oluşturuyordu. Burada tarif edilen, lipofussin benzeri materyalin (sindirilemeyen otofloresan materyal veya UAM olarak adlandırılır) yüksek oranda farklılaşmış primer insan doğum öncesi RPE'sinde (hfRPE) ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı RPE'de birikmesini indükleyen bir yöntemdir. UAM, RPE tarafından fagositoz yoluyla alınan ultraviyole ışıkla işlenmiş OS parçalarının tekrar tekrar beslenmesiyle kültürlerde birikmiştir. UAM'nin lipofuscin in vivo olarak yaklaştığı ve ondan farklı olduğu anahtar yollar da tartışılmaktadır. Bu lipofussin benzeri birikim modeline eşlik ederek, UAM granüllerinin geniş otofloresan spektrumunu eşzamanlı antikor boyamasından ayırt etmek için görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır. Son olarak, UAM'nin RPE fagositoz kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, dış segment fragmanı / uçlarının alımını ve parçalanmasını ölçmek için yeni bir yöntem tanıtılmıştır. "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılan bu yöntem, klasik dış segment "nabız kovalamaca" testlerinde bulunan RPE fagositoz kapasitesinin potansiyel yanlış yorumlarının üstesinden gelir. Burada tanıtılan modeller ve teknikler, lipofussin üretimi ve klirens yollarını ve varsayılan toksisiteyi incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Retinal pigment epiteli (RPE), fotoreseptör dış segment uçlarının veya fragmanlarının günlük alımı ve bozulması da dahil olmak üzere üstteki fotoreseptörler için kritik destek sağlar (bu protokol boyunca, OS kısaltması, tüm dış segmentlerden ziyade OS uçları veya fragmanları anlamına gelir). Post-mitotik RPE'deki bu günlük alım sonunda fagolizozomal kapasiteyi aşırı yükler ve lipofussin adı verilen sindirilemeyen, otofloresan hücre içi materyalin birikmesine yol açar. İlginç bir şekilde, birkaç çalışma RPE lipofuscin'in OS fagositoz ^1,2 olmadan birikebileceğini de göstermiştir. Lipofuscin, görsel siklus retino....

Protokol

İnsan dokusunun edinimi ve kullanımını içeren mevcut protokol, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Foto-oksitlenmiş dış segment uçlarının ve parçalarının hazırlanması

NOT: Koyulaştırılmış sığır retinaları satın alınmış ve buz üzerinde sevk edilmiştir (bkz. Bu retinalardan, işletim sistemi daha önce yayınlanmış bir protokol^23'ü takiben saflaştırıldı.

1. UV lambası ile çapraz bağlama dış segmenti
   1. Slaytları sterilize etmek için politetrafloroetilen kaplı slaytları (bakınız Malzeme....

Tartışmalar

RPE lipofuscin on yıllardır çalışılırken, toksisitesi ^2,9,16,42 tartışılmaktadır. Hayvan modellerinden lipofuscin'in toksisitesi hakkında belirsizlik göz önüne alındığında¹¹, insan RPE'sini kullanan in vitro modeller değerlidir. Bir dizi in vitro lipofussin birikim modeli tanımlanmıştır, ancak hiçbiri hem OS beslenmesini hem de .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000