改进脂褐素模型和高极化人视网膜色素上皮培养物中外段吞噬能力的定量

摘要

该协议描述了高度分化和极化的人视网膜色素上皮（RPE）培养物中的脂褐素积累模型和改进的外段（OS）吞噬测定，以检测RPE的总OS消耗/降解能力。这些方法克服了以前的脂褐素模型和经典的脉搏追逐外段吞噬测定的局限性。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）对感光器外段的日常吞噬作用有助于细胞内衰老色素（称为脂褐素）的积累。脂褐素的毒性在斯塔加特病（最常见的遗传性视网膜变性）中已得到充分证实，但在年龄相关性黄斑变性（AMD）中更具争议性，AMD是发达国家不可逆失明的主要原因。确定人类脂褐素的毒性一直很困难，斯塔加特的动物模型毒性有限。因此，需要模拟人类体内RPE的体外模型来更好地了解脂褐素的产生，清除和毒性。迄今为止，大多数细胞培养脂褐素模型都在细胞系中，或者涉及向RPE喂食复杂脂褐素混合物的单一组分，而不是整个感光器外段的片段/尖端，从而产生更完整和生理性的脂褐素模型。这里描述的是一种诱导脂褐素样物质（称为不可消化自发荧光材料，或UAM）在高度分化的原代人产前RPE（hfRPE）和诱导多能干细胞（iPSC）衍生RPE中积累的方法。UAM通过重复喂食由RPE通过吞噬作用吸收的紫外线处理的OS片段在培养物中积累。还讨论了UAM在体内与脂褐素近似和不同的关键方法。在这种脂褐素样积累模型的同时，介绍了用于区分UAM颗粒的宽自发荧光光谱与并发抗体染色的成像方法。最后，为了评估UAM对RPE吞噬能力的影响，引入了一种量化外段片段/尖端摄取和分解的新方法。该方法被称为“总消耗容量”，克服了经典外段“脉冲追逐”测定中固有的RPE吞噬能力的潜在误解。这里介绍的模型和技术可用于研究脂褐素的生成和清除途径以及推定的毒性。

引言

视网膜色素上皮（RPE）为上覆的光感受器提供关键支持，包括感光器外段尖端或片段的日常摄取和降解（在整个协议中，缩写OS代表OS尖端或片段，而不是整个外段）。这种对有丝分裂后RPE的每日摄取最终使吞噬溶酶体容量过载，并导致难以消化的自发荧光细胞内物质（称为脂褐素）的积聚。有趣的是，一些研究还表明，RPE脂褐素可以在没有OS吞噬作用的情况下积累^1，2。脂褐素具有许多成分，包括源自视觉周期类视黄醇的交联加合物，对于80岁以上的人来说，可以占据RPE细胞体积的近20%³。

脂褐素是否有毒一直备受争议。斯塔加特病是光感受器和RPE的常染色体隐性变性，其中ABCA4的突变触发了光感受器外段内含有的视觉周期类视黄醇的不当处理。不正确的类视黄醇加工会导致异常交联和双类视黄醇物种的形成，包括双类视黄醇 N-视黄亚基亚基-N-视黄基乙醇胺 （A2E）。研究表明A2E毒性的多种机制^4，5。脂褐素有助于临床成像期间眼底自发荧光信号，Stargardt 的患者和动物模型均在视网膜变性前显示眼底自发荧光增加，表明脂褐素水平与毒性之间存在相关性^6，

研究方案

涉及获取和使用人体组织的本协议已由密歇根大学机构审查委员会（HUM00105486）审查和批准。

1.光氧化外段尖端和碎片的制备

注意：深色适应的牛视网膜是在冰上购买和运输的（见 材料表）。从这些视网膜中，按照先前发布的方案²³纯化OS。

1. 外段与紫外灯交联
   1. 将聚四氟乙烯涂层载玻片（参见 材料表）完全浸入70%乙醇中，在生物安全柜中10分钟以对载玻片进行灭菌。让载玻片在无菌的100mm细胞培养皿中风干。
   2. 将每张载玻片放入一个新的 100 mm 细胞培养皿中，并将 200 μL 含血清的细胞培养基（通常用于手头的 RPE 培养物的任何培养基）加入每个矩形中，然后将手持式 254 nm 紫外光（参见 材料表）放在 100 mm 细胞培养皿（无盖）上，灯泡直接面向载玻片， 并曝光20分钟。专门用于本研究的培养基和培养基组件的具体产品编号已于^{先前发布22，23}。该介质在整个协议中称为“RPE 介质”。
      注：介质的紫外线处理会阻挡玻璃表面，并防止操作系统在后续步骤中粘连。
   3. 在37°C（ ....

讨论

虽然RPE脂褐素已经研究了几十年，但其毒性存在争议2，⁹，^16，42。鉴于动物模型¹¹中脂褐素的毒性含糊不清，使用人类RPE的体外模型是有价值的。已经描述了一系列体外脂褐素积累模型，但没有一个模型同时利用OS喂养和高度成熟和分化的人类RPE培养物。这种组合代表了.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000