Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

Resumen

Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

Resumen

La fagocitosis diaria de los segmentos externos de los fotorreceptores por el epitelio pigmentario de la retina (EPR) contribuye a la acumulación de un pigmento de envejecimiento intracelular denominado lipofuscina. La toxicidad de la lipofuscina está bien establecida en la enfermedad de Stargardt, la degeneración retiniana hereditaria más común, pero es más controvertida en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado. Determinar la toxicidad de la lipofuscina en humanos ha sido difícil, y los modelos animales de Stargardt tienen una toxicidad limitada. Por lo tanto, se necesitan modelos in vitro que imiten el EPR humano in vivo para comprender mejor la generación, eliminación y toxicidad de la lipofuscina. La mayoría de los modelos de lipofuscina de cultivo celular hasta la fecha han estado en líneas celulares o han implicado alimentar al EPR con un solo componente de la mezcla compleja de lipofuscina en lugar de fragmentos/puntas de todo el segmento externo de los fotorreceptores, lo que genera un modelo de lipofuscina más completo y fisiológico. Aquí se describe un método para inducir la acumulación de material similar a la lipofuscina (denominado material de autofluorescencia no digerible, o UAM) en RPE prenatal humano primario altamente diferenciado (hfRPE) y RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La UAM se acumuló en cultivos mediante la alimentación repetida de fragmentos de SG tratados con luz ultravioleta absorbidos por el EPR a través de fagocitosis. También se discuten las formas clave en que UAM se aproxima y difiere de la lipofuscina in vivo . Acompañando a este modelo de acumulación similar a la lipofuscina, se introducen métodos de imagen para distinguir el amplio espectro de autofluorescencia de los gránulos de UAM de la tinción concurrente de anticuerpos. Finalmente, para evaluar el impacto de UAM en la capacidad de fagocitosis del EPR, se ha introducido un nuevo método para cuantificar la captación y descomposición de fragmentos / puntas del segmento externo. Denominado "capacidad consuntiva total", este método supera posibles interpretaciones erróneas de la capacidad de fagocitosis del EPR inherente a los ensayos clásicos de "persecución de pulsos" del segmento externo. Los modelos y técnicas introducidos aquí se pueden utilizar para estudiar las vías de generación y eliminación de lipofuscina y la toxicidad putativa.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) proporciona un soporte crítico para los fotorreceptores suprayacentes, incluida la absorción diaria y la degradación de las puntas o fragmentos del segmento externo de los fotorreceptores (a lo largo de este protocolo, la abreviatura OS significa puntas o fragmentos del sistema operativo en lugar de segmentos externos completos). Esta absorción diaria en el EPR postmitótico eventualmente sobrecarga la capacidad fagolisosomal y conduce a la acumulación de material intracelular autofluorescente no digerible, denominado lipofuscina. Curiosamente, varios estudios también han demostrado que la lipofuscina RPE puede acumularse sin ....

Protocolo

El presente protocolo que implica la adquisición y el uso de tejido humano fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan (HUM00105486).

1. Preparación de puntas y fragmentos de segmentos externos fotooxidados

NOTA: Las retinas bovinas adaptadas a la oscuridad se compraron y se enviaron en hielo (consulte la Tabla de materiales). A partir de estas retinas, la SG fue purificada siguiendo un protocolo previamente publicado²³.

1. Reticulación del segmento exterior con una lámpara UV
   1. Sumerja los portaobjetos recubiert....

Discusión

Si bien la lipofuscina RPE se ha estudiado durante décadas, su toxicidad se debate 2,9,16,42. Dada la ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina de modelos animales¹¹, los modelos in vitro que utilizan EPR humano son valiosos. Se ha descrito una gama de modelos de acumulación de lipofuscina in vitro, pero ninguno ha utilizado tanto la alimentaci.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000