A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.

Abstract

من المعروف أن مفصليات الأرجل تنقل مجموعة متنوعة من الفيروسات ذات الأهمية الطبية والزراعية من خلال الدملمف الدموي ، وهو أمر ضروري لانتقال الفيروس. جمع الهيموليمف هو التكنولوجيا الأساسية لدراسة تفاعلات ناقلات الفيروسات. هنا ، نصف طريقة جديدة وبسيطة للجمع الكمي للهيموليمف من المفصليات الصغيرة باستخدام Laodelphax striatellus (نطاط النبات البني الصغير ، SBPH) كنموذج بحثي ، حيث أن هذه المفصليات هي الناقل الرئيسي لفيروس شريط الأرز (RSV). في هذا البروتوكول ، تبدأ العملية بالضغط بلطف على ساق واحدة من المفصليات المجمدة بملاقط ذات رؤوس دقيقة والضغط على الدملمف خارج الجرح. بعد ذلك ، يتم استخدام ماصة صغيرة بسيطة تتكون من لمبة شعرية وماصة لجمع الدملمف المتعدي من الجرح وفقا لمبدأ القوى الشعرية. أخيرا ، يمكن إذابة الدملمف الذي تم جمعه في مخزن مؤقت محدد لمزيد من الدراسة. هذه الطريقة الجديدة لجمع الهيموليمف من المفصليات الصغيرة هي أداة مفيدة وفعالة لمزيد من البحوث حول الفيروسات المنقولة بالمفصليات والتفاعلات بين الفيروسات والفيروسات الناقلة.

Introduction

يمكن أن تنتقل كل من الفيروسات الحيوانية والنباتية عن طريق المفصليات ، وتشكل هذه الفيروسات تهديدا خطيرا لصحة الإنسان وتسبب خسائر اقتصادية هائلة في الزراعة1،2،3. الأهم من ذلك ، أن اللمف المفصلي ، الذي يعمل كجهاز الدورة الدموية وعنصر حيوي في الجهاز المناعي في المفصليات ، يلعب دورا مهما في تنظيم انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات. يتم نقل الفيروسات المكتسبة من خلال أمعاء المفصليات إلى الأنسجة الأخرى فقط بعد الهروب بنجاح من البيئة الليمفاوية الضارة4،5،6،7.

Protocol

1. تربية الحشرات

  1. رفع SBPHs المستخدمة في هذه التجربة في شتلات الأرز (Oryza sativa cv. Nipponbare). ازرع 20 شتلة أرز في حاضنة (65 مم × 200 مم) ، وتنمو عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية فاتحة / 8 ساعات مظلمة.

2. تشريح SBPHs لجمع الدملمف

  1. ضع SBPHs في أنبوب طرد مركزي ، وضعها في حمام جليدي لمدة 10-30 دقيقة.
    ملاحظة: لا تضع SBPHs في حمام الجليد لمدة تقل عن 10 دقائق ، وإلا فقد تنتعش الحشرات.
  2. ضع SBPH مجمدا على شريحة زجاجية (انظر جدول المواد) تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد) مع توجيه بطنه لأعلى. ضبط التركيز على الأرجل الستة للحشرة.
  3. <....

النتائج

نموذج Micropipette وجمع الهيموليمف
لقد طورنا ماصة صغيرة بسيطة يعتمد عملها على القوى الشعرية للأنبوب الشعري. تتكون الماصة الدقيقة من أنبوب شعري ومصباح ماصة (الشكل 1 أ). تتوفر الأنابيب الشعرية بأحجام مختلفة تتراوح من 1 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، ويتم اختيار أحجام الأنبوب .......

Discussion

الهيموليمف هو وسط الجهاز الدوري في المفصليات ، ولا يمكن للفيروسات المنقولة بالمفصليات أن تغزو أنسجة المفصليات الأخرى إلا إذا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئة الهيموليمف المعادية. يعد جمع عينة عالية الجودة من الدملمف الخطوة الأولى في دراسة تفاعلات الفيروس الناقل التي تحدث في ?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1401700) ومن قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (رقم 32090013 ورقم 32072385).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE protein gelBio-rad4561035Protein separation and detection
4% paraformaldehydeSolarbioP1110For fixation of the cells or tissues 
Bradford dye reagentBio-rad5000205Protein concentration detection
CapillaryHirschmann9000101For collecting hemolymph
Cell counting chamberACMECAYA0810Hemocytes counting
Glass slideGitoglas10127105AFor holding insects
Glass slide coated with silaneSigmaS4651-72EAFor holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935Nucleus staining
Microscope cover glassGitoglas10212424CFor microscopic observation
Pipette bulbHirschmann9000101For collecting hemolymph
Prism 8.0 softwareGraphPad Software/Statistical analyses
Stereomicroscope MoticSMZ-168For insect dissection
TweezersTianldP5622For insect dissection
Zeiss inverted microscopeZeissObserver Z1Hemocytes observation

References

  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-vir....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved