طريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي لجمع الدملمف من المفصليات الصغيرة

Summary

وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.

Abstract

من المعروف أن مفصليات الأرجل تنقل مجموعة متنوعة من الفيروسات ذات الأهمية الطبية والزراعية من خلال الدملمف الدموي ، وهو أمر ضروري لانتقال الفيروس. جمع الهيموليمف هو التكنولوجيا الأساسية لدراسة تفاعلات ناقلات الفيروسات. هنا ، نصف طريقة جديدة وبسيطة للجمع الكمي للهيموليمف من المفصليات الصغيرة باستخدام Laodelphax striatellus (نطاط النبات البني الصغير ، SBPH) كنموذج بحثي ، حيث أن هذه المفصليات هي الناقل الرئيسي لفيروس شريط الأرز (RSV). في هذا البروتوكول ، تبدأ العملية بالضغط بلطف على ساق واحدة من المفصليات المجمدة بملاقط ذات رؤوس دقيقة والضغط على الدملمف خارج الجرح. بعد ذلك ، يتم استخدام ماصة صغيرة بسيطة تتكون من لمبة شعرية وماصة لجمع الدملمف المتعدي من الجرح وفقا لمبدأ القوى الشعرية. أخيرا ، يمكن إذابة الدملمف الذي تم جمعه في مخزن مؤقت محدد لمزيد من الدراسة. هذه الطريقة الجديدة لجمع الهيموليمف من المفصليات الصغيرة هي أداة مفيدة وفعالة لمزيد من البحوث حول الفيروسات المنقولة بالمفصليات والتفاعلات بين الفيروسات والفيروسات الناقلة.

Introduction

يمكن أن تنتقل كل من الفيروسات الحيوانية والنباتية عن طريق المفصليات ، وتشكل هذه الفيروسات تهديدا خطيرا لصحة الإنسان وتسبب خسائر اقتصادية هائلة في الزراعة¹،^2،3. الأهم من ذلك ، أن اللمف المفصلي ، الذي يعمل كجهاز الدورة الدموية وعنصر حيوي في الجهاز المناعي في المفصليات ، يلعب دورا مهما في تنظيم انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات. يتم نقل الفيروسات المكتسبة من خلال أمعاء المفصليات إلى الأنسجة الأخرى فقط بعد الهروب بنجاح من البيئة الليمفاوية الضارة⁴،^5،6،7. تتضمن دورة حياة الفيروسات في الهيموليمف المفصلي بقاء الفيروس في بلازما السائل ، والدخول إلى الخلية الدموية ، والانتقال إلى الأنسجة الأخرى ، وتحدث آليات تفاعل مختلفة للفيروس الناقل في الدملمف⁸،⁹،^10،11،12. على سبيل المثال ، يعتمد الانتقال الرأسي ل RSV بواسطة SBPH على التفاعل الجزيئي بين بروتين SBPH vitellogenin وبروتين قفيصة RSV (فيروس شريط الأرز)^13,14. قد تفلت بعض الفيروسات من الاستجابة المناعية للهيموليمف عن طريق ربط عوامل ناقلات محددة¹⁵،¹⁶،^17،18. لذلك ، فإن التحقيق في تفاعلات الفيروس الناقل في الدملمف في المفصليات مهم لتطوير فهم أفضل لانتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات.

يصعب جمع الهيموليمف لبعض الحشرات الصغيرة ، مثل نطاطات النباتات ، نطاطات الأوراق ، وبعض البعوض ، بسبب حجمها. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تطوير عدة طرق لجمع الدملمف ، بما في ذلك إدخال إبرة حقنة مباشرة في جسم الحشرة لاستخراج حجم صغير من الدملمف ، وجمع الإفرازات من موقع الجرح بملاقط ذات رؤوس دقيقة ، والطرد المركزي المباشر. وقد مكنت هذه الطرق من قياس مستويات التعبير الجيني النسبية والتتر الفيروسي داخل الدملمف¹⁹،^20،21. ومع ذلك ، فإن طريقة فعالة لتحديد حجم الهيموليمف ، وهو أمر ضروري لحساب خلايا الدم ، وتحديد كمية البروتين ، وتحليل نشاط الإنزيم ، غير متوفرة حاليا لهذه الحشرات الصغيرة.

SBPH (نطاط النبات البني الصغير) هو نوع من ناقلات الحشرات الصغيرة التي يبلغ طول جسمها حوالي 2-4 ملم. SBPH قادر على نقل مجموعة متنوعة من الفيروسات النباتية ، بما في ذلك RSV ، وفيروس قزم الذرة الخام ، وفيروس قزم الأرز الأسود^{المخطط 22}،^23،24. تمت دراسة التفاعل بين SBPH و RSV بعمق على مدار العقد الماضي. لتسهيل العمل مع SBPHs ، قمنا بتطوير طريقة جديدة وبسيطة لجمع الدملمف. تستخدم هذه الطريقة ، التي تعتمد على مبدأ القوى الشعرية ، شعيرات دموية ذات علامة مقياس للحصول على دملمف الحشرة بطريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي. هذا يسمح لنا بجمع حجم معين من الهيموليمف من الحشرات الصغيرة بكفاءة ودراسة بيئة الدملمف للنواقل الصغيرة بمزيد من التفصيل.

Protocol

1. تربية الحشرات

1. رفع SBPHs المستخدمة في هذه التجربة في شتلات الأرز (Oryza sativa cv. Nipponbare). ازرع 20 شتلة أرز في حاضنة (65 مم × 200 مم) ، وتنمو عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية فاتحة / 8 ساعات مظلمة.

2. تشريح SBPHs لجمع الدملمف

1. ضع SBPHs في أنبوب طرد مركزي ، وضعها في حمام جليدي لمدة 10-30 دقيقة.
   ملاحظة: لا تضع SBPHs في حمام الجليد لمدة تقل عن 10 دقائق ، وإلا فقد تنتعش الحشرات.
2. ضع SBPH مجمدا على شريحة زجاجية (انظر جدول المواد) تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد) مع توجيه بطنه لأعلى. ضبط التركيز على الأرجل الستة للحشرة.
3. قم بإعداد ملقطين عاليتي الدقة (انظر جدول المواد) بأطراف فائقة الدقة. استخدم ملقط واحد للضغط لأسفل على جسم الحشرة لإبقائها في مكانها ، واستخدم الملقط الآخر لسحب إحدى الساقين بعناية من الحشرة.
   ملاحظة: بالنسبة للحشرات ذات القشرة الصلبة ، يمكن استخدام مشرط العيون لقطع إحدى الساقين.
4. اضغط برفق على صدر الحشرة بملقط لجعل الدملمف يتدفق عبر الجرح.
   ملاحظة: يظهر الهيموليمف على شكل قطرات شفافة دون أي زخارف بيضاء مرئية. تخلص من الدهون إذا كان هناك أي فلوكول أبيض ، والذي يمثل تلوث الجسم الدهني.

3. جمع الهيموليمف باستخدام micropipettes

1. تحضير ماصة صغيرة. ضع أنبوبا شعريا (انظر جدول المواد) بحجم 1 ميكرولتر في لمبة الماصة (انظر جدول المواد). للحصول على قياسات دقيقة ، تأكد من أن خط الميزان مرئي.
   ملاحظة: من الضروري وجود ثقب صغير في الجزء العلوي من لمبة الماصة.
2. عند جمع الدملمف ، أمسك لمبة ماصة الماصة ، وضع الأنبوب الشعري بالقرب من جرح الحشرة. جمع الدملمف ينضح من الجرح ببساطة عن طريق لمس طرف الشعيرات الدموية إلى الدملمف.
3. قم بسد الفتحة الصغيرة الموجودة أعلى لمبة الماصة قليلا بالإصبع لإيقاف عملية الامتصاص عندما يصل السائل الموجود داخل الأنبوب الشعري إلى خط المقياس المطلوب.
   ملاحظة: اجمع عينة واحدة من 1 ميكرولتر من الهيموليمف باستمرار وبسرعة لتجنب تلوث الدهون وانسداد الأنبوب.
4. اضغط على لمبة الماصة لتفريغ الهيموليمف المجمع إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS (137 مليمول / لتر NaCI ، 2.7 مليمول / لتر KCI ، 4.3 مليمول / لتر Na 2 HPO 4 ، 1.4 مليمول / لتر KH 2 PO 4 ، درجة الحموضة 7.2-7.4).
   ملاحظة: يتم إدخال الأنبوب الشعري في المخزن المؤقت PBS.
5. التغيير إلى أنبوب شعري جديد عند جمع عينة أخرى 1 ميكرولتر من الدملمف.

4. تلطيخ كوماسي الأزرق

1. اجمع 3 عينات من الدملمف بنفس الحجم (1 ميكرولتر) من يرقات المرحلة الثالثة وفقا للبروتوكولات الموضحة في الخطوة 3 ، وقم بتفريغ الدملمف الذي تم جمعه في المخزن المؤقت PBS لعمل حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
2. أضف 25 ميكرولتر من مخزن تحميل البروتين 5x (250 مليمول / لتر Tris-HCI [درجة الحموضة 6.8] ، 10٪ W / V SDS ، 0.05٪ W / V Bromophenol Blue ، 50٪ W / V glycerol ، 5٪ W / V β-mercaptoethanol) إلى 100 ميكرولتر من عينات الدملمف المخفف ، والحرارة لتشويه البروتينات.
3. قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينات المغلية على جل بروتين SDS-PAGE بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد) لفصل البروتينات.
4. قم بتلطيخ الجل في محلول Coomassie Blue (امزج 1 جم من Coomassie Brilliant Blue R-250 مع 250 مل من الأيزوبروبانول ، و 100 مل من حمض الخليك الجليدي ، و 650 مل من ddH₂O ، وقم بتصفية أي جزيئات باستخدام ورق الترشيح) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة لون الجل لمدة 1 ساعة بمحلول إزالة اللون (100 مل من حمض الخليك ، 400 مل من الميثانول ، 500 مل من ddH₂O).

5. تحديد تركيز البروتين

1. قم بتخفيف 10 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 5 مجم / مل ، 2.5 مجم / مل ، 1.25 مجم / مل ، 0.625 مجم / مل ، و 0.3125 مجم / مل باستخدام محلول PBS باستخدام طريقة التخفيف ذات الشقين.
2. نضح 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS وكل تركيز من محاليل BSA في الخطوة 5.1 ، أضف 1 مل من كاشف صبغة برادفورد واحد (انظر جدول المواد) ، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم المخزن المؤقت PBS في كاشف صبغة برادفورد كعنصر تحكم ، والصفر عند OD = 595 نانومتر. قم بقياس قيم الامتصاص لكل من تركيزات البروتين المتبقية ، وقم بعمل منحنى قياسي.
3. أضف 1 ميكرولتر من الهيموليمف من اليرقات أو الإناث أو الذكور SBPHs إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS ، ثم طرد العينات عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا الدموية.
4. نضح 90 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد ، وقياس قيم امتصاص المادة الطافية وفقا للتعليمات الواردة في الخطوة 5.2.
5. حساب تركيزات البروتين لعينات الدملمف وفقا لمعادلة الانحدار للمنحنى القياسي. قم بتضمين ثلاث نسخ بيولوجية مع ثلاث مكررات تقنية في التجارب.

6. الاكتشافات المجهرية

1. استخدم الماصات الدقيقة لجمع الهيموليمف من 10-15 SBPHs في مراحل النمو المختلفة. أضف الدملمف الذي تم جمعه إلى أنبوب يحتوي على 20 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (انظر جدول المواد). احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لإصلاح الدملمف.
2. ماصة 20 ميكرولتر من الخلايا الدموية الثابتة على مركز شريحة مغلفة بالسيلان (انظر جدول المواد).
3. جفف القطرة في رف تجفيف منزلق.
   ملاحظة: تجنب التجفيف المفرط.
4. قم بتغطية العينة بكاشف الذهب المضاد للتلاشي 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (انظر جدول المواد) ، وافحص الشريحة تحت المجهر المقلوب (انظر جدول المواد).

7. قياس كمية الخلية

1. جمع 1 ميكرولتر من الهيموليمف من SBPHs مع micropipette ، وحلها في 20 ميكرولتر من العازلة PBS.
2. تمييع عينات الدملمف خمسة أضعاف مع العازلة PBS.
3. ماصة 20 ميكرولتر من محلول الدملمف في وسط غرفة عد الخلايا (انظر جدول المواد). قم بتغطية القطرة بغطاء (انظر جدول المواد).
4. عد الخلايا في المربعات الخمسة في غرفة عد الخلايا (الشكل التكميلي 1) ، تحت مجهر مقلوب (انظر جدول المواد). قم بتضمين ثلاث نسخ بيولوجية مع ثلاث مكررات تقنية في كل تجربة.
   الخلايا / ميكرولتر = العدد الإجمالي لخمسة مربعات متوسطة × 5 عامل تخفيف × × 10⁴

8. التحليلات الإحصائية

1. إجراء تحليلات إحصائية باستخدام البرنامج المقابل (انظر جدول المواد). قم بإنشاء ملف جديد ، وحدد العمود ، واستورد البيانات ، وقم بإنشاء مخطط مبعثر باستخدام شريط.
2. احسب المتوسط و SD لكل مجموعة من البيانات باستخدام إحصائيات العمود ، واستخدم أداة ANOVA أحادية الاتجاه لتقييم أهمية الاختلافات بين المجموعات. أوجد المتوسط و SD من ثلاث مكررات بيولوجية بثلاث تجارب مستقلة.

النتائج

نموذج Micropipette وجمع الهيموليمف
لقد طورنا ماصة صغيرة بسيطة يعتمد عملها على القوى الشعرية للأنبوب الشعري. تتكون الماصة الدقيقة من أنبوب شعري ومصباح ماصة (الشكل 1 أ). تتوفر الأنابيب الشعرية بأحجام مختلفة تتراوح من 1 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، ويتم اختيار أحجام الأنبوب ...

Discussion

الهيموليمف هو وسط الجهاز الدوري في المفصليات ، ولا يمكن للفيروسات المنقولة بالمفصليات أن تغزو أنسجة المفصليات الأخرى إلا إذا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئة الهيموليمف المعادية. يعد جمع عينة عالية الجودة من الدملمف الخطوة الأولى في دراسة تفاعلات الفيروس الناقل التي تحدث في ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation