طريقة دقيقة وقابلة للقياس الكمي لجمع الدملمف من المفصليات الصغيرة

Summary

وصفنا طريقة لجمع الهيموليمف القابل للقياس الكمي بكفاءة من المفصليات الصغيرة للتحليل اللاحق.

Abstract

من المعروف أن مفصليات الأرجل تنقل مجموعة متنوعة من الفيروسات ذات الأهمية الطبية والزراعية من خلال الدملمف الدموي ، وهو أمر ضروري لانتقال الفيروس. جمع الهيموليمف هو التكنولوجيا الأساسية لدراسة تفاعلات ناقلات الفيروسات. هنا ، نصف طريقة جديدة وبسيطة للجمع الكمي للهيموليمف من المفصليات الصغيرة باستخدام Laodelphax striatellus (نطاط النبات البني الصغير ، SBPH) كنموذج بحثي ، حيث أن هذه المفصليات هي الناقل الرئيسي لفيروس شريط الأرز (RSV). في هذا البروتوكول ، تبدأ العملية بالضغط بلطف على ساق واحدة من المفصليات المجمدة بملاقط ذات رؤوس دقيقة والضغط على الدملمف خارج الجرح. بعد ذلك ، يتم استخدام ماصة صغيرة بسيطة تتكون من لمبة شعرية وماصة لجمع الدملمف المتعدي من الجرح وفقا لمبدأ القوى الشعرية. أخيرا ، يمكن إذابة الدملمف الذي تم جمعه في مخزن مؤقت محدد لمزيد من الدراسة. هذه الطريقة الجديدة لجمع الهيموليمف من المفصليات الصغيرة هي أداة مفيدة وفعالة لمزيد من البحوث حول الفيروسات المنقولة بالمفصليات والتفاعلات بين الفيروسات والفيروسات الناقلة.

Introduction

يمكن أن تنتقل كل من الفيروسات الحيوانية والنباتية عن طريق المفصليات ، وتشكل هذه الفيروسات تهديدا خطيرا لصحة الإنسان وتسبب خسائر اقتصادية هائلة في الزراعة¹،^2،3. الأهم من ذلك ، أن اللمف المفصلي ، الذي يعمل كجهاز الدورة الدموية وعنصر حيوي في الجهاز المناعي في المفصليات ، يلعب دورا مهما في تنظيم انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات. يتم نقل الفيروسات المكتسبة من خلال أمعاء المفصليات إلى الأنسجة الأخرى فقط بعد الهروب بنجاح من البيئة الليمفاوية الضارة⁴،^5،6،7.

Protocol

1. تربية الحشرات

1. رفع SBPHs المستخدمة في هذه التجربة في شتلات الأرز (Oryza sativa cv. Nipponbare). ازرع 20 شتلة أرز في حاضنة (65 مم × 200 مم) ، وتنمو عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية فاتحة / 8 ساعات مظلمة.

2. تشريح SBPHs لجمع الدملمف

1. ضع SBPHs في أنبوب طرد مركزي ، وضعها في حمام جليدي لمدة 10-30 دقيقة.
   ملاحظة: لا تضع SBPHs في حمام الجليد لمدة تقل عن 10 دقائق ، وإلا فقد تنتعش الحشرات.
2. ضع SBPH مجمدا على شريحة زجاجية (انظر جدول المواد) تحت مجهر مجسم (انظر جدول المواد) مع توجيه بطنه لأعلى. ضبط التركيز على الأرجل الستة للحشرة.
<....

النتائج

نموذج Micropipette وجمع الهيموليمف
لقد طورنا ماصة صغيرة بسيطة يعتمد عملها على القوى الشعرية للأنبوب الشعري. تتكون الماصة الدقيقة من أنبوب شعري ومصباح ماصة (الشكل 1 أ). تتوفر الأنابيب الشعرية بأحجام مختلفة تتراوح من 1 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، ويتم اختيار أحجام الأنبوب .......

Discussion

الهيموليمف هو وسط الجهاز الدوري في المفصليات ، ولا يمكن للفيروسات المنقولة بالمفصليات أن تغزو أنسجة المفصليات الأخرى إلا إذا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئة الهيموليمف المعادية. يعد جمع عينة عالية الجودة من الدملمف الخطوة الأولى في دراسة تفاعلات الفيروس الناقل التي تحدث في ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation