Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Riepilogo

Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Abstract

Gli artropodi sono noti per trasmettere una varietà di virus di importanza medica e agricola attraverso la loro emolinfa, che è essenziale per la trasmissione del virus. La raccolta dell'emolinfa è la tecnologia di base per lo studio delle interazioni virus-vettore. Qui, descriviamo un nuovo e semplice metodo per la raccolta quantitativa di emolinfa da piccoli artropodi usando Laodelphax striatellus (la piccola cavalletta bruna, SBPH) come modello di ricerca, poiché questo artropode è il principale vettore del virus della striscia di riso (RSV). In questo protocollo, il processo inizia pizzicando delicatamente una gamba dell'artropode congelato con una pinzetta a punta fine e premendo l'emolinfa fuori dalla ferita. Quindi, una semplice micropipetta composta da un capillare e un bulbo di pipetta viene utilizzata per raccogliere l'emolinfa trasudativa dalla ferita secondo il principio delle forze capillari. Infine, l'emolinfa raccolta può essere sciolta in un tampone specifico per ulteriori studi. Questo nuovo metodo per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi è uno strumento utile ed efficiente per ulteriori ricerche sugli arbovirus e sulle interazioni vettore-virus.

Introduzione

Sia i virus animali che quelli vegetali possono essere trasmessi dagli artropodi e questi virus rappresentano una grave minaccia per la salute umana e causano enormi perdite economiche in agricoltura ^1,2,3. È importante sottolineare che l'emolinfa degli artropodi, che funge da sistema circolatorio e un elemento vitale del sistema immunitario negli artropodi, svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione arbovirale. I virus acquisiti attraverso l'intestino degli artropodi vengono trasportati ad altri tessuti solo dopo essere sfuggiti con successo all'ambiente emolinfatico avverso 4,5,6,7. Il ciclo di vita dei virus nell'emolinfa degli artropodi comporta la sopravvivenza del virus nel plasma fluido, l'ingresso nell'emocita e il trasporto ad altri tessuti, e vari meccanismi di interazione virus-vettore si verificano nell'emolinfa 8,9,10,11,12. Ad esempio, la trasmissione verticale di RSV da parte dell'SBPH dipende da un'interazione molecolare tra la proteina vitellogenina SBPH e la proteina del capside RSV (virus della striscia di riso)^13,14. Alcuni virus possono sfuggire alla risposta immunitaria dell'emolinfa legando specifici fattori vettoriali^15,16,17,18. Pertanto, lo studio delle interazioni vettore-virus nell'emolinfa degli artropodi è importante per sviluppare una migliore comprensione della trasmissione dell'arbovirus.

L'emolinfa di alcuni piccoli insetti, come cavallette, cicaline e alcune zanzare, è difficile da raccogliere a causa delle loro dimensioni. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati diversi metodi per raccogliere l'emolinfa, tra cui l'inserimento di un ago da siringa direttamente nel corpo dell'insetto per estrarre un microvolume dell'emolinfa, la raccolta dell'essudato dal sito della ferita con pinzette a punta fine e la centrifugazione diretta. Questi metodi hanno permesso la misurazione dei livelli relativi di espressione genica e dei titoli virali all'interno dell'emolinfa 19,20,21. Tuttavia, un metodo efficace per quantificare il volume dell'emolinfa, necessario per il conteggio degli emociti, la quantificazione delle proteine e l'analisi dell'attività enzimatica, non è attualmente disponibile per questi piccoli insetti.

Il SBPH (piccola cavalletta marrone) è un tipo di piccolo insetto vettore con una lunghezza del corpo di circa 2-4 mm. L'SBPH è in grado di trasmettere una varietà di virus vegetali, tra cui RSV, virus nano grezzo del mais e virus nano striato nero del riso^22,23,24. L'interazione tra SBPH e RSV è stata studiata in modo approfondito negli ultimi dieci anni. Per facilitare il lavoro con gli SBPH, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice per raccogliere l'emolinfa. Questo metodo, che si basa sul principio delle forze capillari, utilizza un capillare con un segno di scala per acquisire l'emolinfa dell'insetto in modo preciso e quantificabile. Questo ci permette di raccogliere un volume specifico di emolinfa da piccoli insetti in modo efficiente e di studiare l'ambiente emolinfatico di piccoli vettori in modo più dettagliato.

Protocollo

1. Allevamento di insetti

1. Aumentare le SBPH utilizzate in questo esperimento nelle piantine di riso (Oryza sativa cv. Nipponbare). Piantare 20 piantine di riso in un'incubatrice (65 mm x 200 mm) e crescere a 25 °C sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.

2. Dissezione degli SBPH per la raccolta dell'emolinfa

1. Mettere gli SBPH in una provetta da centrifuga e metterli in un bagno di ghiaccio per 10-30 minuti.
   NOTA: Non posizionare gli SBPH nel bagno di ghiaccio per meno di 10 minuti, altrimenti gli insetti potrebbero rianimarsi.
2. Posizionare un SBPH congelato su un vetrino (vedi Tabella dei materiali) sotto uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali) con l'addome rivolto verso l'alto. Regola la messa a fuoco sulle sei zampe dell'insetto.
3. Preparare due pinzette ad alta precisione (vedi Tabella dei materiali) con punte ultrasottili. Usa una pinzetta per premere sul corpo dell'insetto per tenerlo in posizione, e usa l'altra per estrarre con attenzione una delle zampe dall'insetto.
   NOTA: Per gli insetti con un guscio duro, un bisturi oftalmico può essere utilizzato per tagliare una delle gambe.
4. Premere delicatamente il petto dell'insetto con una pinzetta per far fluire l'emolinfa attraverso la ferita.
   NOTA: L'emolinfa si presenta come goccioline trasparenti senza alcun flocculo bianco visibile. Scartare il lipide se c'è qualche floccullo bianco, che rappresenta la contaminazione del corpo grasso.

3. Raccolta dell'emolinfa con micropipette

1. Preparare una micropipetta. Inserire un tubo capillare (vedere Tabella dei materiali) con un volume di 1 μL nel bulbo della pipetta (vedere Tabella dei materiali). Per misurazioni accurate, assicurarsi che la linea della scala sia visibile.
   NOTA: è necessario un piccolo foro presente sulla parte superiore della lampadina della pipetta.
2. Quando si raccoglie l'emolinfa, tenere il bulbo della pipetta della micropipetta e posizionare il tubo capillare vicino alla ferita dell'insetto. Raccogli l'emolinfa che trasuda dalla ferita semplicemente toccando la punta del capillare all'emolinfa.
3. Bloccare leggermente il piccolo foro sulla parte superiore del bulbo della pipetta con il dito per interrompere il processo di assorbimento quando il liquido all'interno del tubo capillare raggiunge la linea di calcare desiderata.
   NOTA: Raccogliere un campione di 1 μL di emolinfa incessantemente e rapidamente per evitare la contaminazione lipidica e l'ostruzione del tubo.
4. Premere il bulbo della pipetta per scaricare l'emolinfa raccolta in 100 μL di tampone PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
   NOTA: Il tubo capillare viene inserito nel tampone PBS.
5. Passare a un nuovo tubo capillare quando si raccoglie un altro campione di emolinfa da 1 μL.

4. Colorazione blu Coomassie

1. Raccogliere 3 campioni di emolinfa con lo stesso volume (1 μL) dalle larve del 3° stadio secondo i protocolli descritti nella fase 3 e scaricare l'emolinfa raccolta nel tampone PBS per ottenere un volume totale di 100 μL.
2. Aggiungere 25 μL di tampone di carico proteico 5x (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V Bromophenol Blue, 50% W/V glicerolo, 5% W/V β-mercaptoetanolo) in 100 μL dei campioni emolinfatici diluiti e riscaldare per denaturare le proteine.
3. Caricare 20 μL dei campioni bolliti su un gel proteico SDS-PAGE al 10% (vedere Tabella dei materiali) per separare le proteine.
4. Colorare il gel in una soluzione di Coomassie Blue (mescolare 1 g di Coomassie Brilliant Blue R-250 con 250 mL di isopropanolo, 100 mL di acido acetico glaciale e 650 mL di ddH₂O e filtrare eventuali particelle usando carta da filtro) per 1 ora a temperatura ambiente, quindi decolorare il gel per 1 ora con soluzione decolorante (100 mL di acido acetico, 400 mL di metanolo, 500 mL di ddH₂O).

5. Determinazione della concentrazione proteica

1. Diluire 10 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) a 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml e 0,3125 mg/ml con tampone PBS utilizzando il metodo di diluizione a due volte.
2. Aspirare 5 μL di tampone PBS e ogni concentrazione di soluzioni BSA nella fase 5.1, aggiungere 1 mL di 1x reagente colorante Bradford (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare il tampone PBS nel reagente colorante Bradford come controllo e zero a OD = 595 nm. Misurare i valori di assorbanza di ciascuna delle restanti concentrazioni proteiche e fare una curva standard.
3. Aggiungere 1 μL di emolinfa da SBPH larvali, femminili o maschili in 100 μL di tampone PBS, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere gli emociti.
4. Aspirare 90 μL di surnatante in una nuova provetta da centrifuga e misurare i valori di assorbanza del surnatante secondo le istruzioni riportate al punto 5.2.
5. Calcolare le concentrazioni proteiche dei campioni emolinfatici secondo l'equazione di regressione della curva standard. Includere tre repliche biologiche con tre repliche tecniche negli esperimenti.

6. Rilevamenti microscopici

1. Utilizzare micropipette per raccogliere emolinfa da 10-15 SBPH in diverse fasi di sviluppo. Aggiungere l'emolinfa raccolta in un tubo contenente 20 μL di soluzione di paraformaldeide al 4% (vedere Tabella dei materiali). Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti per fissare l'emolinfa.
2. Pipettare 20 μL di emociti fissi al centro di un vetrino rivestito di silano (vedere Tabella dei materiali).
3. Asciugare la goccia in uno stendino.
   NOTA: Evitare un'eccessiva asciugatura.
4. Coprire il campione con il reagente antisbiadimento d'oro 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (vedi Tabella dei materiali) e ispezionare il vetrino al microscopio invertito (vedere Tabella dei materiali).

7. Quantificazione cellulare

1. Raccogliere 1 μL di emolinfa dagli SBPH con una micropipetta e scioglierlo in 20 μL di tampone PBS.
2. Diluire i campioni di emolinfa cinque volte con tampone PBS.
3. Pipettare 20 μL di soluzione emolinfatica al centro della camera di conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali). Coprire la goccia con un coprislip (vedere Tabella dei materiali).
4. Contare le cellule nei cinque quadrati della camera di conteggio delle cellule (Figura supplementare 1), al microscopio invertito (vedi Tabella dei materiali). Includere tre repliche biologiche con tre repliche tecniche in ciascuno degli esperimenti.
   Cellule/μL = conteggio totale di cinque quadrati centrali × fattore di diluizione 5 × × 10⁴

8. Analisi statistiche

1. Eseguire analisi statistiche con il software corrispondente (vedi Tabella dei materiali). Creare un nuovo file e selezionare la colonna, importare i dati e generare un grafico a dispersione con una barra.
2. Calcola la media e la SD per ciascun gruppo di dati utilizzando le statistiche delle colonne e utilizza uno strumento ANOVA unidirezionale per valutare il significato delle differenze tra i gruppi. Determinare la media e la SD da tre repliche biologiche con tre esperimenti indipendenti.

Risultati

Modello di micropipetta e raccolta dell'emolinfa
Abbiamo sviluppato una semplice micropipetta la cui azione si basa sulle forze capillari del tubo capillare. La micropipetta è composta da un tubo capillare e da un bulbo per pipetta (Figura 1A). I tubi capillari sono disponibili in diverse dimensioni di volume che vanno da 1 μL a 20 μL e i volumi dei tubi capillari sono selezionati in base alle esigenze. I tubi capillari con volumi più piccoli non sono suggeriti perch?...

Discussione

L'emolinfa è il mezzo del sistema circolatorio negli artropodi e gli arbovirus possono invadere altri tessuti degli artropodi solo se sono in grado di sopravvivere all'ambiente emolinfatico ostile. La raccolta di un campione di alta qualità di emolinfa è il primo passo nello studio delle interazioni vettore-virus che si verificano nell'emolinfa. È stato riportato che l'emolinfa degli insetti può essere ottenuta da diversi siti sul corpo dell'insetto, tra cui una ferita sulla gamba anteriore, un'incisione minore nell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation