小型節足動物から血リンパを採取するための正確で定量可能な方法

要約

我々は、その後の解析のために、小型節足動物から定量可能な血リンパを効率的に採取する方法について述べる。

要約

節足動物は、ウイルス感染に不可欠な血リンパを介して、医学的および農業的に重要なさまざまなウイルスを感染させることが知られています。血リンパ採取は、ウイルスとベクターの相互作用を研究するための基盤技術です。本稿では,イネストライプウイルス(RSV)の主ベクターである Laodelphax striatellus (小型トビイロウンカ,SBPH)を研究モデルとして,小型節足動物から血リンパを定量的に採取する新規かつ簡便な方法について述べる.このプロトコルでは、このプロセスは、凍った節足動物の片方の足を細いピンセットでそっとつまみ、血リンパを傷口から押し出すことから始まります。次に、毛細血管とピペットバルブからなる単純なマイクロピペットを使用して、毛細管力の原理に従って創傷から浸出性血リンパを収集します。最後に、採取した血リンパは、さらなる研究のために特定の緩衝液に溶解することができる。小型節足動物から血リンパを採取するこの新しい方法は、アルボウイルスとベクター-ウイルス相互作用のさらなる研究のための有用で効率的なツールです。

概要

動物ウイルスと植物ウイルスの両方が節足動物によって伝染する可能性があり、これらのウイルスは人間の健康に深刻な脅威をもたらし、農業に多大な経済的損失をもたらします^1,2,3。重要なことに、節足動物の循環系および免疫系の重要な要素として機能する節足動物の血リンパは、アルボウイルス感染の調節に重要な役割を果たしています。節足動物の腸を介して獲得されたウイルスは、有害な血リンパ環境から首尾よく脱出した後にのみ他の組織に輸送されます^4,5,6,7。節足動物血リンパにおけるウイルスのライフサイクルは、流体血漿中のウイルスの生存、血球への侵入、および他の組織への輸送を含み、血リンパでは様々なウイルス-ベクター相互作用メカニズムが起こります8,9,10,11,12。^<....

プロトコル

1.昆虫の飼育

1. 本実験で用いたSBPHをイネ苗(オリザ・サティバ cv.ニッポンバレー)で育てる。インキュベーター(65 mm x 200 mm)に20本のイネ苗を植え、16時間の明期/ 8時間の暗期の下で25°Cで成長します。

2.血リンパ採取のためのSBPHの解剖

1. SBPHを遠沈管に入れ、氷浴に10〜30分間入れます。
   注意: SBPHを氷浴に10分未満置かないでください、または昆虫が復活する可能性があります。
2. 凍結したSBPHを、腹部を上に向けて実体顕微鏡(材料表を参照)の下のスライドガラス(材料表を参照)に置きます。昆虫の6本の足の焦点を調整します。
3. 超極細の先端を備えた2つの高精度ピンセット( 材料表を参照)を準備します。一方のピンセットを使用して昆虫の体を押し下げて所定の位置に保ち、もう一方のピンセットを使用して片方の足を昆虫から慎重に引き抜きます。
   注:硬い殻を持つ昆虫の場合、眼科用メスを使用して片方の脚を切り取ることができます。
4. ピンセットで昆虫の胸をそっと押して、血リンパを傷口から流出させます。
   注:血リンパは、目に見える白い凝集のない透明な液滴....

ディスカッション

血リンパは節足動物の循環系の媒体であり、アルボウイルスは敵対的な血リンパ環境を生き残ることができる場合にのみ他の節足動物組織に侵入することができます。血リンパの高品質のサンプルを収集することは、血リンパで発生するベクターとウイルスの相互作用を研究するための最初のステップです。昆虫の血リンパは、前脚の傷、頭部の小さな切開、腹部の裂傷など、昆虫の体のい?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation