Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Özet

Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.

Özet

Artropodların, virüs bulaşması için gerekli olan hemolenfleri aracılığıyla tıbbi ve tarımsal öneme sahip çeşitli virüsleri ilettiği bilinmektedir. Hemolenf koleksiyonu, virüs-vektör etkileşimlerini incelemek için temel teknolojidir. Burada, Laodelphax striatellus'u (küçük kahverengi planthopper, SBPH) bir araştırma modeli olarak kullanarak küçük eklembacaklılardan hemolenfin nicel toplanması için yeni ve basit bir yöntem açıklıyoruz, çünkü bu eklembacaklı pirinç şeritli virüsün (RSV) ana vektörüdür. Bu protokolde, işlem, donmuş eklembacaklıların bir bacağını ince uçlu cımbızla hafifçe sıkıştırarak ve hemolenfin yaradan dışarı bastırılmasıyla başlar. Daha sonra, kılcal kuvvetler prensibine göre transüdatif hemolenfin yaradan toplanması için bir kılcal damar ve bir pipet ampulünden oluşan basit bir mikropipet kullanılır. Son olarak, toplanan hemolenf daha fazla çalışma için belirli bir tampon içinde çözülebilir. Küçük eklembacaklılardan hemolenf toplamak için kullanılan bu yeni yöntem, arbovirüsler ve vektör-virüs etkileşimleri hakkında daha fazla araştırma yapmak için yararlı ve etkili bir araçtır.

Giriş

Hem hayvan hem de bitki virüsleri eklembacaklılar tarafından bulaşabilir ve bu virüsler insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmakta ve tarımda muazzam ekonomik kayıplara neden olmaktadır ^1,2,3. Önemli olarak, eklembacaklılarda dolaşım sistemi ve bağışıklık sisteminin hayati bir unsuru olarak görev yapan eklembacaklı hemolenfi, arboviral bulaşmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Eklembacaklı bağırsaklardan edinilen virüsler, ancak olumsuz hemolenf ortamından başarıyla kaçtıktan sonra diğer dokulara taşınır 4,5,6,7. Eklembacaklı hemolenfteki virüslerin yaşam döngüsü, sıvı plazmasında virüs sağkalımını, hemosit içine girişi ve diğer dokulara taşınmasını içerir ve hemolenf 8,9,10,11,12'de çeşitli virüs-vektör etkileşim mekanizmaları meydana gelir. Örneğin, RSV'nin SBPH tarafından dikey iletimi, SBPH vitellogenin proteini ile RSV (pirinç şeridi virüsü) kapsid proteini^13,14 arasındaki moleküler etkileşime bağlıdır. Bazı virüsler, spesifik vektör faktörlerini^15,16,17,18 bağlayarak hemolenfin bağışıklık tepkisinden kaçabilir. Bu nedenle, eklembacaklıların hemolenfindeki vektör-virüs etkileşimlerinin araştırılması, arbovirüs iletiminin daha iyi anlaşılması için önemlidir.

Planthoppers, leafhoppers ve bazı sivrisinekler gibi bazı küçük böceklerin hemolenfi, büyüklükleri nedeniyle toplanması zordur. Bu sorunu çözmek için, hemolenfin mikro hacmini çıkarmak için doğrudan böcek gövdesine bir şırınga iğnesi sokmak, ince uçlu cımbızla yara bölgesinden eksüda toplamak ve doğrudan santrifüjleme dahil olmak üzere hemolenf toplamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, hemolenf ^19,20,21 içindeki göreceli gen ekspresyon seviyelerinin ve viral titrelerin ölçülmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, hemosit sayımı, protein nicelleştirme ve enzim aktivitesi analizi için gerekli olan hemolenf hacmini ölçmek için etkili bir yöntem şu anda bu küçük böcekler için mevcut değildir.

SBPH (küçük kahverengi planthopper), vücut uzunluğu yaklaşık 2-4 mm olan bir tür küçük böcek vektörüdür. SBPH, RSV, mısır kaba cüce virüsü ve pirinç siyah çizgili cüce virüsü^22,23,24 dahil olmak üzere çeşitli bitki virüslerini iletebilir. SBPH ve RSV arasındaki etkileşim son on yılda derinlemesine incelenmiştir. SBPH'lerle çalışmayı kolaylaştırmak için, hemolenf toplamak için yeni ve basit bir yöntem geliştirdik. Kılcal kuvvetler prensibine dayanan bu yöntem, böceğin hemolenfini kesin ve ölçülebilir bir şekilde elde etmek için ölçek işaretli bir kılcal damar kullanır. Bu, küçük böceklerden belirli bir hemolenf hacmini verimli bir şekilde toplamamıza ve küçük vektörlerin hemolenf ortamını daha ayrıntılı olarak incelememize olanak tanır.

Protokol

1. Böcek yetiştiriciliği

1. Bu deneyde kullanılan SBPH'leri pirinç fidelerinde yükseltin (Oryza sativa cv. Nipponbare). Bir inkübatöre (65 mm x 200 mm) 20 pirinç fidesi dikin ve 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyot altında 25 ° C'de büyütün.

2. Hemolenf toplanması için SBPH'lerin diseksiyonu

1. SBPH'leri bir santrifüj tüpüne koyun ve 10-30 dakika boyunca bir buz banyosuna yerleştirin.
   NOT: SBPH'leri buz banyosuna 10 dakikadan daha kısa bir süre koymayın, aksi takdirde böcekler canlanabilir.
2. Dondurulmuş bir SBPH'yi, karnı yukarı bakacak şekilde stereomikroskop altında (bkz. Malzeme Tablosu) bir cam slayt üzerine (bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirin. Odağı böceğin altı bacağına ayarlayın.
3. Ultra ince uçlu iki yüksek hassasiyetli cımbız hazırlayın ( bkz. Yerinde tutmak için böceğin vücuduna bastırmak için bir cımbız kullanın ve diğerini bacaklardan birini böcekten dikkatlice çekmek için kullanın.
   NOT: Sert kabuklu böcekler için, bacaklardan birini kesmek için oftalmik bir neşter kullanılabilir.
4. Hemolenfin yaradan dışarı akmasını sağlamak için böceğin göğsüne bir cımbızla hafifçe bastırın.
   NOT: Hemolenf, görünür beyaz topaklaşma olmadan şeffaf damlacıklar halinde sunulur. Yağ vücut kontaminasyonunu temsil eden herhangi bir beyaz topaklanma varsa lipiti atın.

3. Mikropipetler kullanılarak hemolenf toplanması

1. Bir mikropipet hazırlayın. Pipet ampulünün içine 1 μL hacimli bir kılcal boru (bkz. Malzemeler Tablosu) yerleştirin (bkz. Doğru ölçümler için, ölçek çizgisinin görünür olduğundan emin olun.
   NOT: Pipet ampulünün üst kısmında küçük bir delik gereklidir.
2. Hemolenf toplarken, mikropipetin pipet ampulünü tutun ve kılcal tüpü böcek yarasına yakın yerleştirin. Kılcal damarın ucuna hemolenfe dokunarak yaradan yayılan hemolenfleri toplayın.
3. Kılcal borunun içindeki sıvı istenen kireç çizgisine ulaştığında emme işlemini durdurmak için pipet ampulünün üstündeki küçük deliği parmağınızla hafifçe tıkantın.
   NOT: Lipit kontaminasyonunu ve tüp tıkanmasını önlemek için sürekli ve hızlı bir şekilde 1 μL hemolenf örneği toplayın.
4. Toplanan hemolenfin 100 μL PBS tamponuna (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4) boşaltılması için pipet ampulüne basın.
   NOT: Kılcal boru PBS tamponuna yerleştirilir.
5. Başka bir 1 μL hemolenf örneği toplarken yeni bir kılcal tüpe geçin.

4. Coomassie Mavi boyama

1. 3. aşamada açıklanan protokollere göre 3. aşama larvalarından aynı hacimde (1 μL) 3 hemolenf örneği toplayın ve toplanan hemolenfleri toplam 100 μL hacim yapmak için PBS tamponuna boşaltın.
2. Seyreltilmiş hemolenf numunelerinin 100 μL'sine 25 μL 5x protein yükleme tamponu (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6.8], %10 W/V SDS, %0.05 W/V Bromofenol Mavisi, %50 W/V gliserol, %5 W/V β-merkaptoetanol) ekleyin ve proteinleri denatüre etmek için ısıtın.
3. Proteinleri ayırmak için kaynatılmış numunelerin 20 μL'sini %10'luk bir SDS-PAGE protein jeline yükleyin (bkz.
4. Jeli bir Coomassie Blue çözeltisinde (1 g Coomassie Brilliant Blue R-250'yi 250 mL izopropanol, 100 mL buzul asetik asit ve 650 mL ddH₂O ile karıştırın ve filtre kağıdı kullanarak herhangi bir partikülü filtreleyin) oda sıcaklığında 1 saat boyunca lekeleyin ve ardından jeli 1 saat boyunca renk çözücü çözelti (100 mL asetik asit, 400 mL metanol, 500 mL ddH₂O).

5. Protein konsantrasyonu tayini

1. İki katlı seyreltme yöntemini kullanarak 10 mg/mL sığır serum albüminini (BSA) PBS tamponu ile 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL ve 0,3125 mg/mL'ye seyreltin.
2. Adım 5.1'de 5 μL PBS tamponunu ve her bir BSA çözeltisi konsantrasyonunu aspire edin, 1 mL 1x Bradford boya reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kontrol olarak Bradford boya reaktifinde PBS tamponunu kullanın ve OD = 595 nm'de sıfırı kullanın. Kalan protein konsantrasyonlarının her birinin absorbans değerlerini ölçün ve standart bir eğri yapın.
3. Larval, dişi veya erkek SBPH'lerden 100 μL PBS tamponuna 1 μL hemolenf ekleyin ve ardından hemositleri çıkarmak için numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüye edin.
4. 90 μL süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aspire edin ve süpernatantın absorbans değerlerini adım 5.2'deki talimatlara göre ölçün.
5. Hemolenf örneklerinin protein konsantrasyonlarını standart eğrinin regresyon denklemine göre hesaplayın. Deneylere üç teknik replika ile üç biyolojik replika ekleyin.

6. Mikroskobik tespitler

1. Farklı gelişim aşamalarında 10-15 SBPH'den hemolenf toplamak için mikropipetler kullanın. Toplanan hemolenf, 20 μL% 4 paraformaldehit çözeltisi içeren bir tüpe ekleyin (bkz. Hemolenfi sabitlemek için karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
2. Silanla kaplı bir slaytın ortasına 20 μL sabit hemosit pipeti atın (bkz.
3. Damlacığı bir sürgü kurutma rafında kurutun.
   NOT: Aşırı kurutmadan kaçınınız.
4. Numuneyi altın antifade reaktifi 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile örtün (bakınız Malzeme Tablosu ) ve slaytı ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyin (bakınız Malzeme Tablosu).

7. Hücre nicelleştirme

1. SBPH'lerden bir mikropipet ile 1 μL hemolenf toplayın ve 20 μL PBS tamponunda çözün.
2. Hemolenf numunelerini PBS tamponu ile beş kat seyreltin.
3. Pipet 20 μL hemolenf çözeltisini hücre sayma odasının merkezine yerleştirin (bkz. Damlacığı bir kapak kayması ile örtün (bkz.
4. Hücre sayım odasındaki beş karedeki hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında sayın (Ek Şekil 1). Deneylerin her birine üç teknik replika ile üç biyolojik replika ekleyin.
   Hücreler/μL = beş orta karenin toplam sayısı × 5 × seyreltme faktörü × 10⁴

8. İstatistiksel analizler

1. İlgili yazılımla istatistiksel analizler yapın (bakınız Malzeme Tablosu). Yeni bir dosya oluşturun ve sütunu seçin, verileri içeri aktarın ve çubuklu bir dağılım grafiği oluşturun.
2. Sütun istatistiklerini kullanarak her veri grubu için ortalama ve SD'yi hesaplayın ve gruplar arasındaki farklılıkların önemini değerlendirmek için tek yönlü bir ANOVA aracı kullanın. Üç bağımsız deneyle üç biyolojik kopyadan ortalama ve SD'yi belirleyin.

Sonuçlar

Mikropipet modeli ve hemolenf koleksiyonu
Eylemi kılcal borunun kılcal kuvvetlerine dayanan basit bir mikropipet geliştirdik. Mikropipet, kılcal bir tüp ve bir pipet ampulünden oluşur (Şekil 1A). Kılcal borular 1 μL ila 20 μL arasında değişen farklı hacim boyutlarında mevcuttur ve kılcal boru hacimleri gereksinimlere göre seçilir. Daha küçük hacimli kılcal tüpler önerilmez, çünkü daha küçük hacimli tüplerin ekstra ince açıklıkları hemol...

Tartışmalar

Hemolenf, eklembacaklılardaki dolaşım sisteminin ortamıdır ve arbovirüsler ancak düşmanca hemolenf ortamında hayatta kalabiliyorlarsa diğer eklembacaklı dokuları istila edebilirler. Yüksek kaliteli bir hemolenf örneği toplamak, hemolenfte meydana gelen vektör-virüs etkileşimlerini incelemenin ilk adımıdır. Böcek hemolenfinin, ön bacakta bir yara, baş bölgesinde küçük bir kesi veya karın bölgesinde bir gözyaşı yarası 26,27,28,29 dahil olmak üzere böceğin vücudundaki çeşitli bölgele...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation