Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass Gliederfüßer eine Vielzahl von Viren von medizinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung durch ihre Hämolymphe übertragen, die für die Virusübertragung unerlässlich ist. Die Hämolymphsammlung ist die Basistechnologie für die Untersuchung von Virus-Vektor-Interaktionen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige und einfache Methode zur quantitativen Entnahme von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden unter Verwendung von Laodelphax striatellus (der kleinen braunen Zikade, SBPH) als Forschungsmodell, da dieser Arthropode der Hauptvektor des Reisstreifenvirus (RSV) ist. Bei diesem Protokoll beginnt der Prozess damit, dass ein Bein des gefrorenen Gliederfüßers mit einer Pinzette mit feiner Spitze sanft abgekniffen und die Hämolymphe aus der Wunde gedrückt wird. Dann wird eine einfache Mikropipette, bestehend aus einer Kapillare und einem Pipettenkolben, verwendet, um die transsudative Hämolymphe nach dem Prinzip der Kapillarkräfte aus der Wunde zu entnehmen. Schließlich kann die gesammelte Hämolymphe zur weiteren Untersuchung in einem spezifischen Puffer aufgelöst werden. Diese neue Methode zur Gewinnung von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden ist ein nützliches und effizientes Werkzeug für die weitere Erforschung von Arboviren und Vektor-Virus-Interaktionen.

Einleitung

Sowohl tierische als auch pflanzliche Viren können von Gliederfüßern übertragen werden, und diese Viren stellen eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und verursachen enorme wirtschaftliche Verluste in der Landwirtschaft ^1,2,3. Wichtig ist, dass die Arthropoden-Hämolymphe, die als Kreislaufsystem und lebenswichtiges Element des Immunsystems bei Arthropoden dient, eine wichtige Rolle bei der Regulierung der arboviralen Übertragung spielt. Viren, die über den Darm der Arthropoden erworben wurden, werden erst dann in andere Gewebe transportiert, wenn sie der ungünstigen Hämolymphumgebung erfolgreich entkommen^sind 4,5,6,7. Der Lebenszyklus von Viren in der Arthropoden-Hämolymphe umfasst das Überleben des Virus im flüssigen Plasma, das Eindringen in die Hämozyten und den Transport in andere Gewebe, und in der Hämolymphe treten verschiedene Virus-Vektor-Interaktionsmechanismen auf 8,9,10,11,12. So ist beispielsweise die vertikale Übertragung von RSV durch den SBPH von einer molekularen Interaktion zwischen dem SBPH-Vitellogenin-Protein und dem RSV-Kapsidprotein (Reisstreifenvirus) abhängig^13,14. Einige Viren können der Immunantwort der Hämolymphe entgehen, indem sie bestimmte Vektorfaktoren^{binden 15,16,17,18}. Daher ist die Untersuchung von Vektor-Virus-Interaktionen in der Hämolymphe von Arthropoden wichtig, um ein besseres Verständnis der Arbovirus-Übertragung zu entwickeln.

Die Hämolymphe einiger kleiner Insekten wie Zikaden, Zikaden und einiger Mücken ist aufgrund ihrer Größe schwer zu sammeln. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Methoden zur Hämolymphentnahme entwickelt, darunter das Einführen einer Spritzennadel direkt in den Insektenkörper, um ein Mikrovolumen der Hämolymphe zu extrahieren, das Sammeln von Exsudat aus der Wundstelle mit einer Pinzette mit feiner Spitze und die direkte Zentrifugation. Diese Methoden ermöglichten die Messung der relativen Genexpression und der Virustiter innerhalb der Hämolymphe 19,20,21. Eine effektive Methode zur Quantifizierung des Hämolymphvolumens, die für die Hämolymphzählung, Proteinquantifizierung und Enzymaktivitätsanalyse notwendig ist, steht für diese kleinen Insekten derzeit jedoch nicht zur Verfügung.

Die SBPH (kleine braune Zikade) ist eine Art kleiner Insektenvektor mit einer Körperlänge von etwa 2-4 mm. Der SBPH ist in der Lage, eine Vielzahl von Pflanzenviren zu übertragen, darunter RSV, Mais-Rauhzwergvirus und Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus^22,23,24. Die Wechselwirkung zwischen SBPH und RSV wurde in den letzten zehn Jahren eingehend untersucht. Um die Arbeit mit SBPHs zu erleichtern, haben wir eine neuartige und einfache Methode zur Hämolymphentnahme entwickelt. Bei dieser Methode, die auf dem Prinzip der Kapillarkräfte basiert, wird eine Kapillare mit einer Schuppenmarkierung verwendet, um die Hämolymphe des Insekts präzise und quantifizierbar zu erfassen. Dies ermöglicht es uns, ein bestimmtes Volumen an Hämolymphe von kleinen Insekten effizient zu sammeln und die Hämolymphumgebung kleiner Vektoren genauer zu untersuchen.

Protokoll

1. Insektenzucht

1. Ziehen Sie die SBPHs, die in diesem Experiment verwendet wurden, an Reissämlingen (Oryza sativa cv. Nipponbare) an. Pflanzen Sie 20 Reissetzlinge in einen Inkubator (65 mm x 200 mm) und wachsen Sie bei 25 °C unter einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode.

2. Präparation der SBPHs für die Hämolymphentnahme

1. Geben Sie die SBPHs in ein Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie für 10-30 Minuten in ein Eisbad.
   Anmerkungen: Legen Sie die SBPHs nicht länger als 10 Minuten in das Eisbad, da die Insekten sonst wiederbelebt werden können.
2. Legen Sie einen gefrorenen SBPH mit dem Bauch nach oben auf einen Glasobjektträger (siehe Materialtabelle) unter ein Stereomikroskop (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Fokus auf die sechs Beine des Insekts ein.
3. Bereiten Sie zwei hochpräzise Pinzetten (siehe Materialtabelle) mit ultrafeinen Spitzen vor. Drücke mit einer Pinzette auf den Körper des Insekts, um ihn an Ort und Stelle zu halten, und ziehe mit der anderen vorsichtig eines der Beine vom Insekt ab.
   HINWEIS: Bei Insekten mit harter Schale kann ein Augenskalpell verwendet werden, um eines der Beine abzuschneiden.
4. Drücken Sie mit einer Pinzette sanft auf die Brust des Insekts, damit die Hämolymphe durch die Wunde fließt.
   HINWEIS: Die Hämolymphe präsentiert sich als transparente Tröpfchen ohne sichtbare weiße Flockung. Entsorgen Sie das Lipid, wenn weiße Flocken vorhanden sind, die eine Kontamination des Fettkörpers darstellen.

3. Hämolymphentnahme mit Mikropipetten

1. Bereiten Sie eine Mikropipette vor. Ein Kapillarröhrchen (siehe Materialtabelle) mit einem Volumen von 1 μL in den Pipettenkolben (siehe Materialtabelle) einsetzen. Stellen Sie für genaue Messungen sicher, dass die Skalenlinie sichtbar ist.
   Anmerkungen: Ein kleines Loch auf der Oberseite des Pipettenkolbens ist erforderlich.
2. Halten Sie bei der Entnahme der Hämolymphe den Pipettenkolben der Mikropipette fest und platzieren Sie das Kapillarröhrchen in der Nähe der Insektenwunde. Sammeln Sie die aus der Wunde austretende Hämolymphe, indem Sie einfach die Spitze der Kapillare zur Hämolymphe berühren.
3. Blockieren Sie das kleine Loch auf der Oberseite des Pipettenkolbens leicht mit dem Finger, um den Absorptionsprozess zu stoppen, wenn die Flüssigkeit im Inneren des Kapillarrohrs die gewünschte Skalenlinie erreicht.
   Anmerkungen: Sammeln Sie eine Probe von 1 μl Hämolymphe unaufhörlich und schnell, um eine Lipidkontamination und ein Verstopfen der Röhrchen zu vermeiden.
4. Drücken Sie auf den Pipettenkolben, um die gesammelte Hämolymphe in 100 μl PBS-Puffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4) zu entladen.
   Anmerkungen: Das Kapillarrohr wird in den PBS-Puffer eingeführt.
5. Wechseln Sie zu einem neuen Kapillarröhrchen, wenn Sie eine weitere 1-μl-Hämolymphprobe entnehmen.

4. Coomassie Blue-Färbung

1. Sammeln Sie 3 Hämolymphproben mit dem gleichen Volumen (1 μl) von Larven des 3. Stadiums gemäß den in Schritt 3 beschriebenen Protokollen und entleeren Sie die gesammelte Hämolymphe in den PBS-Puffer, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erhalten.
2. In 100 μl der verdünnten Hämolymphproben werden 25 μl 5x Proteinladepuffer (250 mmol/l Tris-HCI [pH 6,8], 10 % W/V SDS, 0,05 % W/V Bromphenolblau, 50 % W/V Glycerin, 5 % W/V β-Mercaptoethanol) gegeben und erhitzt, um die Proteine zu denaturieren.
3. Geben Sie 20 μl der gekochten Proben auf ein 10%iges SDS-PAGE-Proteingel (siehe Materialtabelle), um die Proteine zu trennen.
4. Färben Sie das Gel 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Coomassie Blue-Lösung (mischen Sie 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 mit 250 ml Isopropanol, 100 ml Eisessig und 650 ml ddH₂O und filtern Sie alle Partikel mit Filterpapier heraus) und entfärben Sie das Gel dann 1 Stunde lang mit Entfärbungslösung (100 ml Essigsäure, 400 ml Methanol, 500 ml_ddH2O).

5. Bestimmung der Proteinkonzentration

1. 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) auf 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml und 0,3125 mg/ml mit PBS-Puffer unter Verwendung der zweifachen Verdünnungsmethode verdünnen.
2. Aspirieren Sie 5 μl PBS-Puffer und jede Konzentration BSA-Lösungen in Schritt 5.1, fügen Sie 1 ml 1x Bradford-Farbstoffreagenz hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie PBS-Puffer in Bradford-Farbstoffreagenz als Kontrolle und Null bei OD = 595 nm. Messen Sie die Absorptionswerte jeder der verbleibenden Proteinkonzentrationen und erstellen Sie eine Standardkurve.
3. Geben Sie 1 μl Hämolymphe von larven, weiblichen oder männlichen SBPHs in 100 μl PBS-Puffer und zentrifugieren Sie dann die Proben bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die Hämozyten zu entfernen.
4. Aspirieren Sie 90 μl Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen und messen Sie die Absorptionswerte des Überstands gemäß den Anweisungen in Schritt 5.2.
5. Berechnen Sie die Proteinkonzentrationen der Hämolymphproben gemäß der Regressionsgleichung der Standardkurve. Beziehen Sie drei biologische Replikate mit drei technischen Repliken in die Experimente ein.

6. Mikroskopische Detektionen

1. Verwenden Sie Mikropipetten, um die Hämolymphe von 10-15 SBPHs in verschiedenen Entwicklungsstadien zu sammeln. Die gesammelte Hämolymphe wird in ein Röhrchen mit 20 μl 4%iger Paraformaldehydlösung gegeben (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Hämolymphe zu fixieren.
2. Pipettieren Sie 20 μl fixierte Hämozyten in die Mitte eines mit Silan beschichteten Objektträgers (siehe Materialtabelle).
3. Trocknen Sie das Tröpfchen in einem Wäscheständer ab.
   Anmerkungen: Vermeiden Sie übermäßiges Trocknen.
4. Bedecken Sie die Probe mit dem Gold-Lichtschutzreagenz 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (siehe Materialtabelle) und untersuchen Sie den Objektträger unter einem inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle).

7. Quantifizierung der Zellen

1. Sammeln Sie 1 μl Hämolymphe mit einer Mikropipette aus den SBPHs und lösen Sie sie in 20 μl PBS-Puffer auf.
2. Verdünnen Sie die Hämolymphproben fünffach mit PBS-Puffer.
3. Pipettieren Sie 20 μl Hämolymphlösung in die Mitte der Zellzählkammer (siehe Materialtabelle). Decken Sie das Tröpfchen mit einem Deckglas ab (siehe Materialtabelle).
4. Zählen Sie die Zellen in den fünf Quadraten der Zellzählkammer (ergänzende Abbildung 1) unter einem inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle). Beziehen Sie drei biologische Replikate mit jeweils drei technischen Repliken in die Experimente ein.
   Zellen/μL = Gesamtzahl von fünf mittleren Quadraten × 5 × Verdünnungsfaktor × 10⁴

8. Statistische Auswertungen

1. Führen Sie statistische Analysen mit der entsprechenden Software durch (siehe Materialtabelle). Erstellen Sie eine neue Datei, wählen Sie die Spalte aus, importieren Sie die Daten, und generieren Sie ein Streudiagramm mit einem Balken.
2. Berechnen Sie den Mittelwert und die SD für jede Datengruppe mithilfe von Spaltenstatistiken, und verwenden Sie ein unidirektionales ANOVA-Tool, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen auszuwerten. Bestimmen Sie den Mittelwert und die SD aus drei biologischen Wiederholungen mit drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

Mikropipettenmodell und Hämolymphsammlung
Wir haben eine einfache Mikropipette entwickelt, deren Wirkung auf den Kapillarkräften des Kapillarrohrs basiert. Die Mikropipette besteht aus einem Kapillarröhrchen und einem Pipettenkolben (Abbildung 1A). Kapillarröhrchen sind in verschiedenen Volumengrößen von 1 μL bis 20 μL erhältlich, wobei die Kapillarröhrchenvolumina je nach Anforderung ausgewählt werden. Kapillarröhrchen mit kleinerem Volumen werden nicht empfo...

Diskussion

Hämolymphe ist das Medium des Kreislaufsystems bei Gliederfüßern, und Arboviren können nur dann in andere Gliederfüßergewebe eindringen, wenn sie in der Lage sind, die feindliche Hämolymphumgebung zu überleben. Die Entnahme einer qualitativ hochwertigen Hämolymphprobe ist der erste Schritt zur Untersuchung der Vektor-Virus-Interaktionen, die in der Hämolymphe auftreten. Es wurde berichtet, dass die Insektenhämolymphe an mehreren Stellen des Körpers des Insekts gewonnen werden kann, einschließlich einer Wunde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation