A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

Abstract

פרוקי רגליים ידועים כמעבירים מגוון וירוסים בעלי חשיבות רפואית וחקלאית דרך ההמולימפה שלהם, החיונית להעברת הנגיף. אוסף Hemolymph הוא הטכנולוגיה הבסיסית לחקר אינטראקציות וירוס-וקטור. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף כמותי של המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות Laodelphax striatellus (הפלנטהופר החום הקטן, SBPH) כמודל מחקר, שכן פרוק רגליים זה הוא הווקטור העיקרי של וירוס פס האורז (RSV). בפרוטוקול זה, התהליך מתחיל בצביטה עדינה של רגל אחת של פרוק הרגליים הקפוא בפינצטה עדינה ולחיצה על ההמולימפה מתוך הפצע. לאחר מכן, micropipette פשוט המורכב נימים נורה פיפטה משמש לאסוף את hemolymph transudative מן הפצע על פי העיקרון של כוחות נימים. לבסוף, ניתן להמיס את ההמולימפה שנאספה לתוך חיץ ספציפי למחקר נוסף. שיטה חדשה זו לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים היא כלי שימושי ויעיל למחקר נוסף על ארבו-וירוסים ואינטראקציות וקטור-וירוס.

Introduction

וירוסים הן של בעלי חיים והן של צמחים יכולים להיות מועברים על ידי פרוקי רגליים, ונגיפים אלה מהווים איום חמור על בריאות האדם וגורמים להפסדים כלכליים עצומים בחקלאות 1,2,3. חשוב לציין כי המולימפה של פרוקי הרגליים, המשמשת כמערכת הדם וכמרכיב חיוני של מערכת החיסון בפרוקי רגליים, ממלאת תפקיד חשוב בוויסות ההעברה הארבו-ויראלית. וירוסים הנרכשים דרך מעי פרוקי הרגליים מועברים לרקמות אחרות רק לאחר בריחה מוצלחת מסביבת המולימפה השלילית 4,5,6,7. מחזור החיים של וירוס....

Protocol

1. גידול חרקים

  1. העלו את ה-SBPHs המשמשים בניסוי זה בשתילי אורז (Oryza sativa cv. Nipponbare). שתול 20 שתילי אורז באינקובטור (65 מ"מ x 200 מ"מ), וגדל ב 25 ° C תחת 16 שעות אור / 8 שעות כהה.

2. נתיחת SBPHs לאוסף המולימפה

  1. הכניסו את SBPHs לתוך צינור צנטריפוגה, והניחו אותם באמבט קרח למשך 10-30 דקות.
    הערה: אין להניח את ה-SBPHs באמבט הקרח למשך פחות מ-10 דקות, אחרת החרקים עלולים להתעורר.
  2. הניחו SBPH קפוא על מגלשת זכוכית (ראו טבלת חומרים) מתחת לסטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה. התאימו את המיקוד לשש רגליו של החרק.....

תוצאות

דגם מיקרופיפטה וקולקציית המולימפה
פיתחנו מיקרופיפטה פשוטה שפעולתה מבוססת על הכוחות הקפילריים של צינור הנימים. המיקרופיפטה מורכבת מצינור נימי ומנורת פיפטה (איור 1A). צינורות נימים זמינים בגדלי נפח שונים הנעים בין 1 μL ל 20 μL, ונפחי הצינור הנימי נבחרים בהתאם לדרישו?.......

Discussion

המולימפה הוא המדיום של מערכת הדם בפרוקי רגליים, וארבו-וירוסים יכולים לפלוש לרקמות פרוקי רגליים אחרות רק אם הם מסוגלים לשרוד את סביבת ההמולימפה העוינת. איסוף מדגם איכותי של המולימפה הוא הצעד הראשון בחקר אינטראקציות וקטור-וירוס המתרחשות בהמולימפה. דווח כי ניתן להשיג המולימפה של חרקים ממספ?.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המו"פ הלאומית של סין (מס '2022YFD1401700) ועל ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס '32090013 ומס '32072385).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE protein gelBio-rad4561035Protein separation and detection
4% paraformaldehydeSolarbioP1110For fixation of the cells or tissues 
Bradford dye reagentBio-rad5000205Protein concentration detection
CapillaryHirschmann9000101For collecting hemolymph
Cell counting chamberACMECAYA0810Hemocytes counting
Glass slideGitoglas10127105AFor holding insects
Glass slide coated with silaneSigmaS4651-72EAFor holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935Nucleus staining
Microscope cover glassGitoglas10212424CFor microscopic observation
Pipette bulbHirschmann9000101For collecting hemolymph
Prism 8.0 softwareGraphPad Software/Statistical analyses
Stereomicroscope MoticSMZ-168For insect dissection
TweezersTianldP5622For insect dissection
Zeiss inverted microscopeZeissObserver Z1Hemocytes observation

References

  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-vir....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved