שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

Summary

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

Abstract

פרוקי רגליים ידועים כמעבירים מגוון וירוסים בעלי חשיבות רפואית וחקלאית דרך ההמולימפה שלהם, החיונית להעברת הנגיף. אוסף Hemolymph הוא הטכנולוגיה הבסיסית לחקר אינטראקציות וירוס-וקטור. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף כמותי של המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות Laodelphax striatellus (הפלנטהופר החום הקטן, SBPH) כמודל מחקר, שכן פרוק רגליים זה הוא הווקטור העיקרי של וירוס פס האורז (RSV). בפרוטוקול זה, התהליך מתחיל בצביטה עדינה של רגל אחת של פרוק הרגליים הקפוא בפינצטה עדינה ולחיצה על ההמולימפה מתוך הפצע. לאחר מכן, micropipette פשוט המורכב נימים נורה פיפטה משמש לאסוף את hemolymph transudative מן הפצע על פי העיקרון של כוחות נימים. לבסוף, ניתן להמיס את ההמולימפה שנאספה לתוך חיץ ספציפי למחקר נוסף. שיטה חדשה זו לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים היא כלי שימושי ויעיל למחקר נוסף על ארבו-וירוסים ואינטראקציות וקטור-וירוס.

Introduction

וירוסים הן של בעלי חיים והן של צמחים יכולים להיות מועברים על ידי פרוקי רגליים, ונגיפים אלה מהווים איום חמור על בריאות האדם וגורמים להפסדים כלכליים עצומים בחקלאות ^1,2,3. חשוב לציין כי המולימפה של פרוקי הרגליים, המשמשת כמערכת הדם וכמרכיב חיוני של מערכת החיסון בפרוקי רגליים, ממלאת תפקיד חשוב בוויסות ההעברה הארבו-ויראלית. וירוסים הנרכשים דרך מעי פרוקי הרגליים מועברים לרקמות אחרות רק לאחר בריחה מוצלחת מסביבת המולימפה השלילית 4,5,6,7. מחזור החיים של וירוס....

Protocol

1. גידול חרקים

1. העלו את ה-SBPHs המשמשים בניסוי זה בשתילי אורז (Oryza sativa cv. Nipponbare). שתול 20 שתילי אורז באינקובטור (65 מ"מ x 200 מ"מ), וגדל ב 25 ° C תחת 16 שעות אור / 8 שעות כהה.

2. נתיחת SBPHs לאוסף המולימפה

1. הכניסו את SBPHs לתוך צינור צנטריפוגה, והניחו אותם באמבט קרח למשך 10-30 דקות.
   הערה: אין להניח את ה-SBPHs באמבט הקרח למשך פחות מ-10 דקות, אחרת החרקים עלולים להתעורר.
2. הניחו SBPH קפוא על מגלשת זכוכית (ראו טבלת חומרים) מתחת לסטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה. התאימו את המיקוד לשש רגליו של החרק.....

תוצאות

דגם מיקרופיפטה וקולקציית המולימפה
פיתחנו מיקרופיפטה פשוטה שפעולתה מבוססת על הכוחות הקפילריים של צינור הנימים. המיקרופיפטה מורכבת מצינור נימי ומנורת פיפטה (איור 1A). צינורות נימים זמינים בגדלי נפח שונים הנעים בין 1 μL ל 20 μL, ונפחי הצינור הנימי נבחרים בהתאם לדרישו?.......

Discussion

המולימפה הוא המדיום של מערכת הדם בפרוקי רגליים, וארבו-וירוסים יכולים לפלוש לרקמות פרוקי רגליים אחרות רק אם הם מסוגלים לשרוד את סביבת ההמולימפה העוינת. איסוף מדגם איכותי של המולימפה הוא הצעד הראשון בחקר אינטראקציות וקטור-וירוס המתרחשות בהמולימפה. דווח כי ניתן להשיג המולימפה של חרקים ממספ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation