Une méthode précise et quantifiable pour recueillir l’hémolymphe de petits arthropodes

Résumé

Nous décrivons une méthode pour recueillir efficacement l’hémolymphe quantifiable de petits arthropodes pour une analyse ultérieure.

Résumé

Les arthropodes sont connus pour transmettre une variété de virus d’importance médicale et agricole par leur hémolymphe, qui est essentielle à la transmission du virus. La collecte d’hémolymphe est la technologie de base pour étudier les interactions virus-vecteur. Ici, nous décrivons une méthode nouvelle et simple pour la collecte quantitative de l’hémolymphe de petits arthropodes en utilisant Laodelphax striatellus (la petite cicadelle brune, SBPH) comme modèle de recherche, car cet arthropode est le principal vecteur du virus de la bande du riz (VRS). Dans ce protocole, le processus commence par pincer doucement une jambe de l’arthropode congelé avec une pince à épiler à pointe fine et presser l’hémolymphe hors de la plaie. Ensuite, une micropipette simple composée d’un capillaire et d’un bulbe de pipette est utilisée pour recueillir l’hémolymphe transsudative de la plaie selon le principe des forces capillaires. Enfin, l’hémolymphe recueillie peut être dissoute dans un tampon spécifique pour une étude plus approfondie. Cette nouvelle méthode de collecte de l’hémolymphe de petits arthropodes est un outil utile et efficace pour la poursuite des recherches sur les arbovirus et les interactions vecteur-virus.

Introduction

Les virus animaux et végétaux peuvent être transmis par les arthropodes, et ces virus constituent une grave menace pour la santé humaine et causent d’énormes pertes économiques dans l’agriculture ^1,2,3. Il est important de noter que l’hémolymphe des arthropodes, qui sert de système circulatoire et d’élément vital du système immunitaire chez les arthropodes, joue un rôle important dans la régulation de la transmission des arboviraux. Les virus acquis par les intestins des arthropodes ne sont transportés vers d’autres tissus qu’après avoir réussi à s’échapper de l’environnement hémolymphe indésirable 4,5,6,7. Le cycle de vie des virus dans l’hémolymphe arthropode implique la survie du virus dans le plasma fluide, l’entrée dans l’hémocyte et le transport vers d’autres tissus, et divers mécanismes d’interaction virus-vecteur se produisent dans l’hémolymphe 8,9,10,11,12. Par exemple, la transmission verticale du VRS par l’HBPS dépend d’une interaction moléculaire entre la protéine vitellogénine SBPH et la protéine de capside RSV (virus de la bande de riz)^13,14. Certains virus peuvent échapper à la réponse immunitaire de l’hémolymphe en se liant à des facteurs vectoriels spécifiques^15,16,17,18. Par conséquent, il est important d’étudier les interactions vecteur-virus dans l’hémolymphe des arthropodes pour mieux comprendre la transmission des arbovirus.

L’hémolymphe de certains petits insectes, tels que les cicadelles, les cicadelles et certains moustiques, est difficile à recueillir en raison de leur taille. Pour résoudre ce problème, plusieurs méthodes ont été développées pour recueillir l’hémolymphe, y compris l’insertion d’une aiguille de seringue directement dans le corps de l’insecte pour extraire un microvolume de l’hémolymphe, la collecte de l’exsudat du site de la plaie avec une pince à épiler à pointe fine et la centrifugation directe. Ces méthodes ont permis de mesurer les niveaux relatifs d’expression génique et les titres viraux dans l’hémolymphe 19,20,21. Cependant, une méthode efficace pour quantifier le volume de l’hémolymphe, qui est nécessaire pour le comptage des hémocytes, la quantification des protéines et l’analyse de l’activité enzymatique, n’est actuellement pas disponible pour ces petits insectes.

Le SBPH (small brown planthopper) est un type de petit insecte vecteur d’une longueur de corps d’environ 2-4 mm. Le SBPH est capable de transmettre une variété de virus végétaux, y compris le VRS, le virus nain rugueux du maïs et le virus nain strié noir de riz^22,23,24. L’interaction entre l’HBP et le VRS a été étudiée en profondeur au cours de la dernière décennie. Pour faciliter le travail avec les SBPH, nous avons développé une méthode nouvelle et simple de collecte de l’hémolymphe. Cette méthode, basée sur le principe des forces capillaires, utilise un capillaire avec un repère d’écaille pour acquérir l’hémolymphe de l’insecte de manière précise et quantifiable. Cela nous permet de collecter efficacement un volume spécifique d’hémolymphe de petits insectes et d’étudier plus en détail l’environnement hémolymphe de petits vecteurs.

Protocole

1. Élevage d’insectes

1. Augmenter les SBPH utilisés dans cette expérience dans les plants de riz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Planter 20 plants de riz dans un incubateur (65 mm x 200 mm) et pousser à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.

2. Dissection des SBPH pour le prélèvement de l’hémolymphe

1. Mettez les SBPH dans un tube à centrifuger et placez-les dans un bain de glace pendant 10-30 min.
   REMARQUE: Ne placez pas les SBPH dans le bain de glace pendant moins de 10 minutes, sinon les insectes pourraient revivre.
2. Placer une SBPH congelée sur une lame de verre (voir Tableau des matériaux) sous un stéréomicroscope (voir Table des matériaux) avec son abdomen tourné vers le haut. Ajustez la mise au point sur les six pattes de l’insecte.
3. Préparez deux pinces à épiler de haute précision (voir Tableau des matériaux) avec des pointes ultra-fines. Utilisez une pince à épiler pour appuyer sur le corps de l’insecte afin de le maintenir en place, et utilisez l’autre pour retirer soigneusement l’une des pattes de l’insecte.
   REMARQUE: Pour les insectes à coquille dure, un scalpel ophtalmique peut être utilisé pour couper l’une des jambes.
4. Appuyez doucement sur la poitrine de l’insecte avec une pince à épiler pour faire couler l’hémolymphe à travers la plaie.
   REMARQUE: L’hémolymphe se présente sous forme de gouttelettes transparentes sans flocule blanche visible. Jetez le lipide s’il y a de la flocule blanche, qui représente la contamination du corps gras.

3. Prélèvement d’hémolymphe à l’aide de micropipettes

1. Préparez une micropipette. Placez un tube capillaire (voir le tableau des matériaux) d’un volume de 1 μL dans l’ampoule de la pipette (voir le tableau des matériaux). Pour des mesures précises, assurez-vous que la ligne d’échelle est visible.
   REMARQUE: Un petit trou présent sur le dessus de l’ampoule de la pipette est nécessaire.
2. Lors de la collecte de l’hémolymphe, tenez le bulbe de la pipette de la micropipette et placez le tube capillaire près de la plaie de l’insecte. Recueillir l’hémolymphe exsudant de la plaie en touchant simplement l’extrémité du capillaire à l’hémolymphe.
3. Boucher légèrement le petit trou sur le dessus de l’ampoule de la pipette avec le doigt pour arrêter le processus d’absorption lorsque le liquide à l’intérieur du tube capillaire atteint la ligne d’échelle souhaitée.
   REMARQUE : Prélever un échantillon de 1 μL d’hémolymphe sans cesse et rapidement pour éviter la contamination lipidique et le colmatage des tubes.
4. Appuyez sur l’ampoule de la pipette pour évacuer l’hémolymphe recueillie dans 100 μL de tampon PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L_Na2HPO4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
   REMARQUE: Le tube capillaire est inséré dans le tampon PBS.
5. Passez à un nouveau tube capillaire lors du prélèvement d’un autre échantillon de 1 μL d’hémolymphe.

4. Coloration Coomassie Blue

1. Prélever 3 échantillons d’hémolymphe de même volume (1 μL) de larves de 3e stade selon les protocoles décrits à l’étape 3, et déverser l’hémolymphe recueillie dans le tampon PBS pour obtenir un volume total de 100 μL.
2. Ajouter 25 μL de tampon de charge protéique 5x (250 mmol/L de Tris-HCI [pH 6,8], 10 % P/V SDS, 0,05 % P/V de bleu de bromophénol, 50 % P/V de glycérol, 5 % P/V β-mercaptoéthanol) dans 100 μL des échantillons d’hémolymphe dilués, et chauffer pour dénaturer les protéines.
3. Charger 20 μL des échantillons bouillis sur un gel protéique SDS-PAGE à 10 % (voir le tableau des matières) pour séparer les protéines.
4. Colorer le gel dans une solution de Coomassie Blue (mélanger 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 avec 250 mL d’isopropanol, 100 mL d’acide acétique glacial et 650 mL de_ddH2O, et filtrer les particules éventuelles à l’aide de papier filtre) pendant 1 h à température ambiante, puis décolorer le gel pendant 1 h avec une solution décolorante (100 mL d’acide acétique, 400 mL de méthanol, 500 mL de_ddH2O).

5. Détermination de la concentration en protéines

1. Diluer 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL et 0,3125 mg/mL avec un tampon PBS en utilisant la méthode de dilution double.
2. Aspirer 5 μL de tampon PBS et chaque concentration de solutions BSA à l’étape 5.1, ajouter 1 mL de 1x réactif colorant Bradford (voir Tableau des matériaux) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Utilisez le tampon PBS dans le réactif de colorant Bradford comme témoin, et zéro à OD = 595 nm. Mesurez les valeurs d’absorbance de chacune des concentrations de protéines restantes et faites une courbe standard.
3. Ajouter 1 μL d’hémolymphe provenant de SBPH larvaires, femelles ou mâles dans 100 μL de tampon PBS, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les hémocytes.
4. Aspirer 90 μL de surnageant dans un nouveau tube à centrifuger et mesurer les valeurs d’absorbance du surnageant conformément aux instructions de l’étape 5.2.
5. Calculer les concentrations protéiques des échantillons d’hémolymphe selon l’équation de régression de la courbe standard. Inclure trois réplicats biologiques avec trois réplicats techniques dans les expériences.

6. Détections microscopiques

1. Utilisez des micropipettes pour recueillir l’hémolymphe de 10 à 15 SBPH à différents stades de développement. Ajouter l’hémolymphe recueillie dans un tube contenant 20 μL de solution de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matières). Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min pour fixer l’hémolymphe.
2. Pipeter 20 μL d’hémocytes fixes sur le centre d’une lame recouverte de silane (voir Tableau des matières).
3. Sécher la gouttelette dans un séchoir à lames.
   REMARQUE: Évitez le séchage excessif.
4. Couvrir l’échantillon avec le réactif antidécoloration à l’or 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (voir le tableau des matières) et inspecter la lame au microscope inversé (voir le tableau des matériaux).

7. Quantification cellulaire

1. Prélever 1 μL d’hémolymphe des SBPH avec une micropipette et le dissoudre dans 20 μL de tampon PBS.
2. Diluer les échantillons d’hémolymphe cinq fois avec un tampon PBS.
3. Pipeter 20 μL de solution d’hémolymphe au centre de la chambre de comptage cellulaire (voir Tableau des matériaux). Couvrir la gouttelette avec un bordereau de couverture (voir le tableau des matériaux).
4. Comptez les cellules dans les cinq carrés de la chambre de comptage des cellules (figure supplémentaire 1), sous un microscope inversé (voir le tableau des matériaux). Inclure trois réplicats biologiques avec trois réplicats techniques dans chacune des expériences.
   Cellules/μL = numération totale de cinq carrés du milieu × 5 × facteur de dilution × 10⁴

8. Analyses statistiques

1. Effectuer des analyses statistiques avec le logiciel correspondant (voir Tableau des matières). Créez un nouveau fichier, sélectionnez la colonne, importez les données et générez un nuage de points avec une barre.
2. Calculez la moyenne et l’écart type pour chaque groupe de données à l’aide de statistiques sur colonne et utilisez un outil d’ANOVA unidirectionnel pour évaluer la signification des différences entre les groupes. Déterminez la moyenne et l’écart-type de trois répétitions biologiques à l’aide de trois expériences indépendantes.

Résultats

Modèle de micropipette et collecte d’hémolymphe
Nous avons développé une micropipette simple dont l’action est basée sur les forces capillaires du tube capillaire. La micropipette est composée d’un tube capillaire et d’une ampoule de pipette (Figure 1A). Les tubes capillaires sont disponibles en différentes tailles de volume allant de 1 μL à 20 μL, et les volumes de tubes capillaires sont sélectionnés en fonction des exigences. Les tubes capillaires av...

Discussion

L’hémolymphe est le milieu du système circulatoire chez les arthropodes, et les arbovirus ne peuvent envahir d’autres tissus d’arthropodes que s’ils sont capables de survivre à l’environnement hostile de l’hémolymphe. La collecte d’un échantillon d’hémolymphe de haute qualité est la première étape de l’étude des interactions vecteur-virus qui se produisent dans l’hémolymphe. Il a été rapporté que l’hémolymphe d’insecte peut être obtenue à partir de plusieurs sites sur le corps de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation