التروية الدموية السريعة الفعالة في Xenopus

Summary

يظهر هنا بروتوكول فعال لنضح الدم السريع لإعداد عينات الأنسجة من الضفادع الأفريقية ذات المخالب لدراسات النسخ والبروتينات.

Abstract

كانت Xenopus كائنات نموذجية قوية لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من 100 عام. هنا ، يتم تعريف بروتوكول نضح الدم السريع في Xenopus ، والذي يهدف إلى انخفاض ثابت وجذري للدم داخل جميع الأنسجة. يتم إجراء التروية عن طريق إدخال إبرة مباشرة في بطين القلب وضخ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر نظام الأوعية الدموية. يمكن إكمال الإجراء في حوالي 10 دقائق لكل. يهيمن على الدم عدد قليل من البروتينات وأنواع الخلايا الوفيرة للغاية ، مما يخلق العديد من المشكلات لأن هذه البروتينات تخفي معظم الجزيئات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. سيستفيد التوصيف القابل للتكرار لأنسجة Xenopus البالغة مع البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية من تطبيق هذا البروتوكول قبل أخذ عينات الأعضاء. يتم تعريف بروتوكولات أخذ عينات الأنسجة في الأوراق المصاحبة. تهدف هذه الإجراءات إلى توحيد الممارسات عبر Xenopus من مختلف الجنس والعمر والحالة الصحية ، وتحديدا X. laevis و X. tropicalis.

Introduction

يتم الانتهاء من نضح البرمائيات بالكامل بشكل روتيني لأغراض الحفظ والتثبيت¹،²،³،⁴،^5،6. ومع ذلك ، تحدث هذه الإجراءات بمعدل يحد من عدد العينات الطازجة التي يمكن أخذها لكل. الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول فعال لنضح الدم في Xenopus ، مع إعطاء الأولوية لسرعة هذه التقنية. يستغرق البروتوكول أقل من 10 دقائق لكل ل X. tropicalis وأقل من 15 دقيقة لكل X. laevis. الأولويات الثانوية هي سهولة النسخ واستخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة بحيث يمكن مشاركة العينات عالية الجودة على نطاق واسع بين مختبرات Xenopus.

تستخدم ضفادع Xenopus على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لدراسة العمليات البيولوجية والمرضية الأساسية المحفوظة عبر الأنواع. هذا رباعي الأرجل له علاقة تطورية أوثق مع الثدييات من النماذج المائية الأخرى ، حيث يحتوي على رئتين وقلب من ثلاث غرف وأطراف ذات أرقام. يستخدم المجتمع الدولي Xenopus بشكل فعال لاكتساب فهم أعمق للأمراض البشرية من خلال نمذجة الأمراض المتعمقة والتحليل الجزيئي لوظيفة الجينات المرتبطة بالمرض. المزايا العديدة ل Xenopus كنموذج حيواني تجعلها أدوات لا تقدر بثمن لدراسة الأساس الجزيئي للتنمية البشرية والمرض. وتشمل هذه المزايا: حجم البويضة والجنين الكبير ، والخصوبة العالية ، وسهولة السكن ، والتطور الخارجي السريع ، وسهولة التلاعب الجينومي. تشير التقديرات إلى أن Xenopus يشارك ~ 80٪ من جينات الأمراض البشرية المحددة⁷.

بالمقارنة مع نماذج الثدييات الشائعة ، يعد Xenopus نموذجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة ، مع سهولة هدم المورفولينو وتوافر الجينات المحورة الفعالة والطفرات الجينية المستهدفة باستخدام CRISPR⁸. تم تطبيق قياس الطيف الكتلي الكمي والنسخ أحادي الخلية بنجاح على أجنة Xenopus ^9,10 ، لكن أطلس الخلايا الأخير من Xenopus laevis يظهر أن تكوين معظم الأنسجة تهيمن عليه أنواع خلايا الدم ¹¹. من خلال تطوير تقنية تقوم بإخراج الأنسجة بمعدل سريع واستخدام الوسائط المبردة ، تتأثر نضارة العينة إلى الحد الأدنى بالتروية. هذا مهم بشكل خاص للتطبيقات التي يكون الهدف فيها هو تحديد mRNA غير المضطرب من الناحية الفسيولوجية أو تعبير البروتين.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا لقواعد وأنظمة كلية الطب بجامعة هارفارد IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان) (IS 00001365_3).

ملاحظة: على الرغم من أن الطريقة الأساسية للقتل الرحيم الموصوفة تعتبر تقنية مقبولة للقتل الرحيم من قبل الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية¹² ، إلا أنه لم يتم العثور عليها تؤدي إلى توقف ضربات القلب¹³. حتى الطريقة الثانوية المستخدمة بشكل متكرر للضرب المزدوج لا تمنع ذلك ، ولا إزالة القلب من الحيوان. يعتبر استنزاف الحيوانات المخدرة طريقة إنسانية وفعالة للقتل الرحيم^{الناجح 12}. نظرا لأن الحفاظ على الأنسجة الطازجة من خلال القتل الرحيم هو الهدف من هذا البروتوكول ، فمن المفيد أن يستمر القلب في النبض من خلال القتل الرحيم الأولي باستخدام MS-222 ، وهذا التروية هو في حد ذاته طريقة ثانوية للقتل الرحيم من خلال الاستنزاف.

1. التحضير

1. تأكد من أن المؤسسة البحثية قد وافقت على تقنية القتل الرحيم والتروية الموضحة في هذا البروتوكول.
2. تحضير محلول 5 جم / لتر MS-222 (تريكايين ميثان سلفونات) و 5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم. يجب أن يكون الحجم أكبر من الحجم المطلوب لتغطية الحيوانات التي يتم قتلها رحيما بالكامل. تحقق من الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنه ≥7.
3. تحضير 500 ميكرولتر من 180 وحدة / مل من الهيبارين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل X. laevis ، أو 200 ميكرولتر لكل X. tropicalis.
4. إجراء القتل الرحيم الأولي عن طريق وضع Xenopus في هذا الحل (من الخطوة 1.2) ؛ سيبقى الحيوان مغمورا لمدة 1 ساعة.
5. تأكد من أن Xenopus قد فقد استجابته للألم عن طريق قرص القدم لمدة 15 دقيقة في القتل الرحيم. إذا كان الحيوان تفاعليا ، فأعده إلى محلول القتل الرحيم حتى تضيع هذه الاستجابة.
6. قم بوزن Xenopus واتخاذ أي قياسات إضافية مطلوبة قبل أخذ العينات.
7. باستخدام إبرة 31 G ، حقن X. laevis مع 250 ميكرولتر و X. tropicalis مع 100 ميكرولتر من 180 U / mL الهيبارين في PBS (من الخطوة 1.3) في عضلات كل طرف أمامي.
8. تحضير محلول 1 مل / جم من وزن الحيوان 54 وحدة / مل من الهيبارين في بيرفوسات PBS. قد يجد الأفراد الأكثر خبرة في هذا البروتوكول أن هناك حاجة إلى وسائط أقل لإكمال التروية.
9. استخدم إبرة تحت الجلد 22 جم لإثراء X. laevis ، وإبرة تحت الجلد 25 جم ل X. tropicali s. قم بتخفيف إبرة التروية عن طريق تقليم الطرف بقواطع الأسلاك (الشكل 1)¹⁴.
   ملاحظة: هذا يقلل من احتمال ثقب الإبرة من خلال البطين إذا تم تحريكها. بالإضافة إلى التقشير ، قد يتم طحن الإبرة قليلا بحصوات أو ملف شحذ ، لكنها تظل حادة بما يكفي لاختراق البطين.
10. قم بإعداد المضخة عن طريق توصيل الإبرة المشذبة وتعميم 54 وحدة / مل من بيرفوسات PBS الهيبارين (من الخطوة 1.8). تأكد من تطهير جميع فقاعات الهواء من الأنبوب للقضاء على احتمال انسداد الهواء ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التروية أو الفشل (انظر الجدول 1). احتفظ بوسائط التروية على الثلج طوال مدة الإجراء.
11. إذا كانت المضخة غير قابلة للبرمجة ، مع وجود الإبرة في مكانها ، فقم بقياس حجم الوسائط التي يتم ضخها تحت الإعدادات المختلفة لتحديد الإعدادات الأقرب إلى 5 مل / دقيقة و 10 مل / دقيقة. سيتم استخدام معدلات التدفق هذه بغض النظر عن الأنواع. إذا كانت مضخة التروية قابلة للبرمجة ، فقم بمعايرتها مع وضع الإبرة في مكانها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
12. ضع سطح التشريح (صينية أو لوح رغوي) على منحدر داخل حاوية ثانوية ، أو رتبه لتسهيل تصريف الدم.
13. بمجرد أن يكون الضفدع في المحلول لمدة 1 ساعة ، يكون القتل الرحيم الأولي قد اكتمل. قم بإزالة الضفدع وأعد فحص فقدان استجابة الألم عن طريق إجراء قرصة القدم.
14. ضع الضفدع على ظهره وقم بتثبيت كل طرف (الشكل 2). إذا كان الحفاظ على أنسجة الأطراف مطلوبا ، فقد يتم وضع دبابيس رفيعة من خلال الأرقام أو الدبابيس على شكل حرف U حول الأطراف.
15. باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع الجلد ، حتى خط الوسط ، ثم بشكل جانبي ، مما يجعل اثنين من اللوحات. (الشكل 2)
16. استخدم الملقط للإمساك بالخط العريض وسحبه بعيدا عن التجويف القولوني (الشكل 3). استخدم المقص بعناية لتقطيع العضلات. اصنع لوحتين من جدار التجويف وقم بقص أو تثبيت جميع اللوحات بعيدا عن الطريق.
17. استخدم مقص التشريح لقطع العظام الغرابية وقطع الأنسجة الزائدة للوصول بشكل أفضل إلى القلب (الشكل 3).
18. يجب أن يظل القلب ينبض. إذا توقف القلب عن النبض قبل التروية ، لاحظ أن نضارة العينة قد تعرضت للخطر.

2. التروية

1. حدد المعدة وقم بتحريكها برفق بحيث تكون أعلى الفص الأيسر من الكبد (على يمين المشاهد) ، مع ظهور الأوعية الدموية طوال مدة الإجراء. تحديد الرئة وإمساكها من طرفها باستخدام ملقط الأنسجة. اسحب الرئة خارج التجويف القولوني وثبتها من خلال الطرف (الشكل 4). افعل ذلك برفق ، لأن الأوعية الدموية المكسورة لا تتخلل جيدا. لاحظ ما إذا كان الدم مرئيا داخل الفص ، لأن هذا سيؤثر على القدرة على تحديد اكتمال الإجراء.
2. التقط صورة للتجويف القولوني لتقييم كفاءة التروية بشكل أفضل وربما تحديد الأنسجة غير الطبيعية في وقت لاحق.
3. حدد التامور الرقيق واسحبه باستخدام ملقط الأنسجة (الشكل 5). قم بثقب التامور برفق باستخدام طرف مقص استئصال القزحية ، مع الحرص على عدم قطع الأنسجة الكامنة. قشر التأمور بعيدا عن حجرات القلب الثلاث.
4. استخدم الملقط للإمساك بالبطين برفق من قمته. ضع ضغطا محدودا بحيث يكون هناك مساحة كافية بين أسطح الجر للملقط حتى تمر إبرة التروية (الشكل 6).
5. أدخل الإبرة من خلال إغلاق الملقط في حجرة البطين ، مع الحرص على عدم ثقب البطين (الشكل 7). ثبت ملقط الأنسجة في مكانه باستخدام حامل إبرة باستخدام مرقئ.
   ملاحظة: تعمل هذه التقنية على تثبيت موضع الإبرة ، والذي لا يزال حادا. سيؤدي تثبيت الإبرة مباشرة إلى البطين أيضا إلى تلف غير ضروري ، مما يجعل إعادة التثبيت أكثر صعوبة إذا لزم الأمر (انظر الجدول 1).
6. ابدأ تدفق المضخة عند حوالي 5 مل / دقيقة. سوف تغرق الغرف الثلاث للقلب والجذع الشرياني (الشكل 8 ؛ انظر الجدول 1).
7. باستخدام المقص ، قم بلف الأذن اليمنى بعناية (على يسار المشاهد) ؛ سوف يتدفق الدم. اضبط معدل التدفق على 5 مل / دقيقة أو قم بزيادته إلى 10 مل / دقيقة.
8. استمر حتى تبيض الأوعية الدموية في المعدة (انظر الجدول 1) ، ثم انس الأذن اليسرى للقلب (على يمين المشاهد). إذا كان معدل التدفق لا يزال 5 مل / دقيقة ، فقم بزيادته إلى حوالي 10 مل / دقيقة.
9. استخدم ماصة نقل لشطف التجويف القولوني في وسائط التروية ، للمساعدة في الحفاظ على الرؤية وتقييم لون البيرفوسات المتدفقة من الأذنين بشكل أفضل.
10. حافظ على الإبرة في مكانها حتى يصبح البيروسوات المتدفقة من الأذنين صافية (انظر الجدول 1) وتفقد الرئة لونها الأحمر (انظر الجدول 1 ؛ الشكل 9).

النتائج

بعد التروية الناجحة ، ستكون جميع الأنسجة (باستثناء الكبد في Xenopus المصطبغ) أخف وزنا بشكل واضح وأقل تشبعا بالدم. ستصبح الأوعية الدموية الرئيسية أقل وضوحا (الشكل 10) ، وستشطف الأنسجة (باستثناء الكبد) بشكل نظيف في المخزن المؤقت بعد أخذ العينات. في حين أن التنفيذ الناجح للبرو?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنيات التشريح التقليدية للوصول إلى تجويف coelomic. التقنيات الأخرى مقبولة أيضا ، بشرط أن تسبب الحد الأدنى من الضرر للأنسجة ، ويمكن الوصول إلى القلب ، وتكون الرئة والمعدة مرئية. وبالمثل ، يمكن استبدال معظم أدوات التشريح المدرجة بسهولة بعناصر قابلة للمقارنة.

...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP