التروية الدموية السريعة الفعالة في Xenopus

Summary

يظهر هنا بروتوكول فعال لنضح الدم السريع لإعداد عينات الأنسجة من الضفادع الأفريقية ذات المخالب لدراسات النسخ والبروتينات.

Abstract

كانت Xenopus كائنات نموذجية قوية لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من 100 عام. هنا ، يتم تعريف بروتوكول نضح الدم السريع في Xenopus ، والذي يهدف إلى انخفاض ثابت وجذري للدم داخل جميع الأنسجة. يتم إجراء التروية عن طريق إدخال إبرة مباشرة في بطين القلب وضخ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر نظام الأوعية الدموية. يمكن إكمال الإجراء في حوالي 10 دقائق لكل. يهيمن على الدم عدد قليل من البروتينات وأنواع الخلايا الوفيرة للغاية ، مما يخلق العديد من المشكلات لأن هذه البروتينات تخفي معظم الجزيئات وأنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية. سيستفيد التوصيف القابل للتكرار لأنسجة Xenopus البالغة مع البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية من تطبيق هذا البروتوكول قبل أخذ عينات الأعضاء. يتم تعريف بروتوكولات أخذ عينات الأنسجة في الأوراق المصاحبة. تهدف هذه الإجراءات إلى توحيد الممارسات عبر Xenopus من مختلف الجنس والعمر والحالة الصحية ، وتحديدا X. laevis و X. tropicalis.

Introduction

يتم الانتهاء من نضح البرمائيات بالكامل بشكل روتيني لأغراض الحفظ والتثبيت¹،²،³،⁴،^5،6. ومع ذلك ، تحدث هذه الإجراءات بمعدل يحد من عدد العينات الطازجة التي يمكن أخذها لكل. الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول فعال لنضح الدم في Xenopus ، مع إعطاء الأولوية لسرعة هذه التقنية. يستغرق البروتوكول أقل من 10 دقائق لكل ل X. tropicalis وأقل من 15 دقيقة لكل X. laevis. الأولويات الثانوية هي سهولة النسخ واستخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة بحيث يمكن مشا....

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا لقواعد وأنظمة كلية الطب بجامعة هارفارد IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان) (IS 00001365_3).

ملاحظة: على الرغم من أن الطريقة الأساسية للقتل الرحيم الموصوفة تعتبر تقنية مقبولة للقتل الرحيم من قبل الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية¹² ، إلا أنه لم يتم العثور عليها تؤدي إلى توقف ضربات القلب¹³. حتى الطريقة الثانوية المستخدمة بشكل متكرر للضرب المزدوج لا تمنع ذلك ، ولا إزالة القلب من الحيوان. يعتبر استنزاف الحيوانات المخدرة طريقة إنسانية وفعالة للقتل الرحيم^{الناجح 12}. نظرا لأن الحفاظ على الأنسجة الطازجة من خلال القتل الرحيم هو الهدف من هذا ا....

النتائج

بعد التروية الناجحة ، ستكون جميع الأنسجة (باستثناء الكبد في Xenopus المصطبغ) أخف وزنا بشكل واضح وأقل تشبعا بالدم. ستصبح الأوعية الدموية الرئيسية أقل وضوحا (الشكل 10) ، وستشطف الأنسجة (باستثناء الكبد) بشكل نظيف في المخزن المؤقت بعد أخذ العينات. في حين أن التنفيذ الناجح للبرو?.......

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنيات التشريح التقليدية للوصول إلى تجويف coelomic. التقنيات الأخرى مقبولة أيضا ، بشرط أن تسبب الحد الأدنى من الضرر للأنسجة ، ويمكن الوصول إلى القلب ، وتكون الرئة والمعدة مرئية. وبالمثل ، يمكن استبدال معظم أدوات التشريح المدرجة بسهولة بعناصر قابلة للمقارنة.

.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP