Ksenopusta etkili hızlı kan perfüzyonu

Özet

Burada, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için Afrika pençeli kurbağalarından doku örnekleri hazırlamak için etkili bir hızlı kan perfüzyon protokolü sunulmaktadır.

Özet

Xenopus , 100 yılı aşkın bir süredir omurgalı gelişimini ve hastalığını anlamak için güçlü model organizmalar olmuştur. Burada, Xenopus'ta, tüm dokularda kanın tutarlı ve sert bir şekilde azaltılmasını amaçlayan hızlı bir kan perfüzyon protokolü tanımlanmıştır. Perfüzyon, bir iğnenin doğrudan kalbin ventrikülüne sokulması ve heparinize fosfat tamponlu salinin (PBS) vasküler sistem yoluyla pompalanmasıyla gerçekleştirilir. İşlem hayvan başına yaklaşık 10 dakika içinde tamamlanabilir. Kan, birkaç bol miktarda protein ve hücre tipi tarafından yönetilir ve bu proteinler diğer moleküllerin ve hücre tiplerinin çoğunu maskelediği için sayısız sorun yaratır. Yetişkin Xenopus dokularının kantitatif proteomik ve tek hücreli transkriptomik ile tekrarlanabilir karakterizasyonu, organ örneklemesinden önce bu protokolün uygulanmasından fayda sağlayacaktır. Doku örneklemesi protokolleri eşlik eden makalelerde tanımlanmıştır. Bu prosedürler, Xenopus'ta farklı cinsiyet, yaş ve sağlık durumuna, özellikle X. laevis ve X . tropicalis'e sahip uygulamaların standartlaştırılmasını amaçlamaktadır.

Giriş

Amfibilerin tüm vücut perfüzyonu, 1,2,3,4,5,6'nın korunması ve^{sabitlenmesi amacıyla} rutin olarak tamamlanır. Bununla birlikte, bu prosedürler hayvan başına alınabilecek taze numune sayısını sınırlayan bir oranda gerçekleşir. Bu çalışmanın amacı, tekniğin hızına öncelik vererek Xenopus'ta etkili bir kan perfüzyon protokolü geliştirmektir. Protokol, X. tropicalis için hayvan başına 10 dakikadan az ve X. laevis hayvanı başına 15 dakikadan az sürer. İkincil öncelikler, çoğaltma kolaylığı ve kolayca elde edilen ekipmanların kullanılmasıdır, böylece yüksek kaliteli numuneler Xenopus laboratuvarları arasında yaygın olarak paylaşılabilir.

Xenopus kurbağaları, türler arasında korunan temel biyolojik ve patolojik süreçleri incelemek için biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tetrapod, memelilerle diğer su modellerinden daha yakın bir evrimsel ilişkiye sahiptir, akciğerlere, üç odacıklı bir kalbe ve basamaklı uzuvlara sahiptir. Uluslararası toplum, derinlemesine hastalık modellemesi ve hastalıkla ilişkili gen fonksiyonunun moleküler analizi yoluyla insan hastalığını daha iyi anlamak için Xenopus'u etkili bir şekilde kullanmaktadır. Xenopus'un bir hayvan modeli olarak sayısız avantajı, onları insan gelişiminin ve hastalığının moleküler temelini incelemek için paha biçilmez araçlar haline getirir; Bu avantajlar şunlardır: büyük yumurta ve embriyo boyutu, yüksek doğurganlık, barınma kolaylığı, hızlı dış gelişim ve genomik manipülasyon kolaylığı. Xenopus'un tanımlanan insan hastalığı genlerinin ~% 80'ini paylaştığı tahmin edilmektedir⁷.

Popüler memeli modelleriyle karşılaştırıldığında, Xenopus, morfolino yıkma kolaylığı ve CRISPR⁸ kullanarak verimli transgeniklerin ve hedeflenen gen mutasyonlarının mevcudiyeti ile hızlı, uygun maliyetli bir modeldir. Kantitatif kütle spektrometrisi ve tek hücreli transkriptomik, Xenopus embriyolarına ^9,10 başarıyla uygulanmıştır, ancak Xenopus laevis'in yakın tarihli bir hücre atlası, çoğu dokunun bileşiminin kan hücresi tipleri¹¹ tarafından domine edildiğini göstermektedir. Dokuyu hızlı bir şekilde ekssanguine eden bir teknik geliştirilerek ve soğutulmuş ortam kullanılarak, numunenin tazeliği perfüzyondan minimum düzeyde etkilenir. Bu, özellikle amacın fizyolojik olarak bozulmamış mRNA veya protein ekspresyonunun profilini çıkarmak olduğu uygulamalar için önemlidir.

Protokol

Tüm deneyler Harvard Tıp Fakültesi IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) (IS 00001365_3) kural ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Tarif edilen birincil ötenazi yöntemi, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği¹² tarafından ötenazi için kabul edilebilir bir teknik olarak kabul edilmesine rağmen, kalp atışının durmasına yol açtığı bulunmamıştır¹³. Sık kullanılan ikincil çift korsanlık yöntemi bile bunu engellemez ve kalbi hayvandan çıkarmaz. Anestezi uygulanan hayvanların exsanguinasyonu, başarılı ötenazi¹² için insancıl ve etkili bir yöntem olarak kabul edilir. Ötanazi yoluyla taze dokuların korunması bu protokolün amacı olduğundan, kalbin MS-222 ile primer ötenazi yoluyla atmaya devam etmesi ve perfüzyonun kendisinin ekssanguinasyon yoluyla ikincil bir ötenazi yöntemi olması faydalıdır.

1. Hazırlık

1. Araştırma kurumunun bu protokolde açıklanan ötenazi ve perfüzyon tekniğini onayladığından emin olun.
2. 5 g / L MS-222 (trikain metansülfonat) ve 5 g / L sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın. Hacim, ötenazi yapılan hayvanları tamamen örtmek için gereken hacimden daha büyük olmalıdır. ≥7 olduğundan emin olmak için pH'ı kontrol edin.
3. X. laevis başına fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 500 μL 180 U/mL heparin veya X. tropicalis başına 200 μL hazırlayın.
4. Xenopus'u bu çözeltiye yerleştirerek birincil ötenazi gerçekleştirin (adım 1.2'den itibaren); Hayvan toplam 1 saat su altında kalacaktır.
5. Xenopus'un ayağını 15 dakika ötenaziye sıkıştırarak ağrı tepkisini kaybettiğini doğrulayın. Hayvan reaktif ise, bu yanıt kaybolana kadar ötenazi çözeltisine geri gönderin.
6. Xenopus'u tartın ve numune almadan önce gereken ek ölçümleri yapın.
7. 31 G'lik bir iğne kullanarak, X. laevis'i 250 μL ve X. tropicalis'i PBS'de 100 μL 180 U / mL heparin ile (adım 1.3'ten itibaren) her bir ön ayağın kas sistemine enjekte edin.
8. PBS perfüzyonatta 54 U/mL heparin hayvan ağırlığının 1 mL/g çözeltisini hazırlayın. Bu protokolle daha deneyimli bireyler, perfüzyonu tamamlamak için daha az ortamın gerekli olduğunu görebilirler.
9. X. laevis'i perfüze etmek için 22 G hipodermik iğne ve X. tropicalis için 25 G hipodermik iğne kullanın. Ucu tel kesicilerle keserek perfüzyon iğnesini köreltin (Şekil 1)¹⁴.
   NOT: Bu, kaydırıldığında iğnenin ventrikülden delinme olasılığını azaltır. Körelmeye ek olarak, iğne bir bileme taşı veya törpüsü ile hafifçe öğütülebilir, ancak yine de ventrikülü delecek kadar keskin kalabilir.
10. Kesilmiş iğneyi takarak ve 54 U/mL heparinize PBS perfusatı dolaştırarak pompayı hazırlayın (adım 1.8'den itibaren). Perfüzyon verimliliğinin azalmasına veya arızalanmasına neden olan hava embolisi olasılığını ortadan kaldırmak için tüm hava kabarcıklarını borudan temizlediğinizden emin olun (bkz. Tablo 1). Perfüzyon ortamını işlem süresince buz üzerinde tutun.
11. Pompa programlanabilir değilse, iğne yerindeyken, hangi ayarların 5 mL/dak ve 10 mL/dak'ya en yakın olduğunu belirlemek için farklı ayarlar altında pompalanan ortam hacmini ölçün. Bu akış hızları, türlerden bağımsız olarak kullanılacaktır. Perfüzyon pompası programlanabilirse, üreticinin talimatlarını izleyerek iğne yerinde olacak şekilde kalibre edin.
12. Diseksiyon yüzeyini (tepsi veya köpük levha) ikincil bir kap içindeki bir eğime yerleştirin veya kan drenajını kolaylaştırmak için düzenleyin.
13. Kurbağa 1 saat boyunca çözeltide kaldıktan sonra, birincil ötenazi tamamlanmıştır. Kurbağayı çıkarın ve bir ayak sıkışması yaparak ağrı tepkisi kaybını tekrar kontrol edin.
14. Kurbağayı sırtına yerleştirin ve her bir uzvunu sabitleyin (Şekil 2). Uzuvların dokusunun korunması gerekiyorsa, uzuvların etrafındaki rakamlardan veya U şeklindeki zımbalardan ince pimler yerleştirilebilir.
15. Diseksiyon makası kullanarak, cildi kesin, orta çizgiyi yukarı çıkarın ve sonra yanal olarak iki kanat yapın. (Şekil 2)
16. Linea alba'yı kavramak ve koelomik boşluktan uzaklaştırmak için forseps kullanın (Şekil 3). Kas sistemini kesmek için dikkatlice makas kullanın. Boşluk duvarından iki kanat yapın ve tüm kanatları yoldan kesin veya sabitleyin.
17. Korakoid kemikleri kesmek için diseksiyon makası kullanın ve kalbe daha iyi erişim sağlamak için fazla dokuyu kesin (Şekil 3).
18. Kalp hala atıyor olmalı. Perfüzyondan önce kalp atmayı durdurduysa, numunenin tazeliğinin tehlikeye girdiğini unutmayın.

2. Perfüzyon

1. Mideyi tanımlayın ve yavaşça kaydırın, böylece karaciğerin sol lobunun üstünde (izleyicinin sağında), vaskülatürü prosedür boyunca görülebilir. Bir akciğeri tanımlayın ve doku forsepslerini kullanarak ucundan tutun. Akciğeri koelomik boşluğun dışına çekin ve ucundan geçirin (Şekil 4). Bunu nazikçe yapın, çünkü kırık kan damarları iyi perfüze etmez. Lob içinde kan olup olmadığına dikkat edin, çünkü bu, prosedürün tamamlanmasını belirleme yeteneğini etkileyecektir.
2. Perfüzyon etkinliğini daha iyi değerlendirmek ve daha sonraki bir tarihte potansiyel olarak anormal dokuları tanımlamak için koelomik boşluğun bir görüntüsünü alın.
3. İnce perikardı tanımlayın ve doku forseps ile öğretilen çekin (Şekil 5). İridektomi makaslarının ucunu kullanarak perikardı nazikçe delin, altta yatan dokuları kesmemeye dikkat edin. Perikardın kalbin üç odasından uzağa soyun.
4. Ventrikülü tepesinden nazikçe kavramak için forseps kullanın. Perfüzyon iğnesinin geçmesi için forsepsin çekiş yüzeyleri arasında yeterli boşluk olacak şekilde sınırlı basınç uygulayın (Şekil 6).
5. İğneyi forsepslerin kapatılmasından ventrikülün odasına sokun, ventrikülden delinmemeye dikkat edin (Şekil 7). Bir hemostat kullanarak bir iğne tutucu kullanarak doku forsepslerini yerinde kelepçeleyin.
   NOT: Bu teknik, hala keskin olan iğnenin konumunu stabilize eder. İğnenin doğrudan ventriküle sıkıştırılması da gereksiz hasara neden olur ve gerektiğinde geri kazanımı zorlaştırır (bkz. Tablo 1).
6. Pompanın akışını yaklaşık 5 mL/dak hızla başlatın. Kalbin ve arteriyel gövdenin üç odacığı engorge olacaktır (Şekil 8; bakınız Tablo 1).
7. Makasla, sağ kulak kepçesini dikkatlice mızraklayın (izleyicinin solunda); kan dökülecek. Akış hızını 5 mL/dak olarak ayarlayın veya 10 mL/dk'ya yükseltin.
8. Midenin vaskülatürü ağlayana kadar devam edin (bakınız Tablo 1), sonra kalbin sol kulak kepçesini (izleyicinin sağında) mızraklayın. Akış hızı hala 5 mL / dak ise, yaklaşık 10 mL / dak'ya yükseltin.
9. Perfüzyon ortamındaki koelomik boşluğu durulamak, görünürlüğün korunmasına yardımcı olmak ve kulak kepçelerinden akan perfüzyonatın rengini daha iyi değerlendirmek için bir transfer pipeti kullanın.
10. Kulak kepçelerinden akan perfüzyonat berraklaşana kadar (bakınız Tablo 1) ve akciğer kırmızı tonunu kaybedene kadar iğneyi yerinde tutun (bakınız Tablo 1; Şekil 9).

Sonuçlar

Başarılı perfüzyonu takiben, tüm dokular (pigmentli Xenopus'taki karaciğer hariç) belirgin şekilde daha hafif ve kanla daha az doygun olacaktır. Büyük kan damarları daha az fark edilir hale gelecektir (Şekil 10) ve dokular (karaciğer hariç) örneklendikten sonra tamponda temiz bir şekilde durulanacaktır. Protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi nihai olarak yalnızca exsanguinated doku örneklerinden elde edilen verilerin kalitesi ile doğrulanabilirken, ...

Tartışmalar

Bu protokol, koelomik kaviteye erişmek için geleneksel diseksiyon tekniklerini tanımlar. Diğer teknikler de, dokulara minimum zarar vermeleri, kalbe erişilebilir olmaları ve akciğer ve midenin görünür olması koşuluyla kabul edilebilir. Benzer şekilde, listelenen çoğu diseksiyon aleti kolayca karşılaştırılabilir öğelerle değiştirilebilir.

Bu prosedürün etkinliğini optimize etmek için girişimlerde bulunulmuş olsa da, sonuçlar kişinin deneyimine ve bireysel kurbağ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP