זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

Summary

מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.

Abstract

קסנופוס הם יצורי מודל רבי עוצמה להבנת התפתחות ומחלות של בעלי חוליות כבר למעלה מ-100 שנה. כאן מוגדר פרוטוקול זילוח דם מהיר בקסנופוס, שמטרתו הפחתה עקבית ודרסטית של הדם בכל הרקמות. הזלוף מתבצע על ידי החדרת מחט ישירות לחדר הלב ושאיבת מלח חוצץ פוספט (PBS) דרך מערכת כלי הדם. ניתן להשלים את ההליך תוך כ -10 דקות לכל חיה. הדם נשלט על ידי כמה חלבונים וסוגי תאים נפוצים מאוד, מה שיוצר בעיות רבות מכיוון שחלבונים אלה מסווים את רוב המולקולות וסוגי התאים האחרים המעניינים. האפיון הניתן לשחזור של רקמות קסנופוס בוגרות עם פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי יפיק תועלת מיישום פרוטוקול זה לפני דגימת האיברים. הפרוטוקולים לדגימת רקמות מוגדרים בניירות נלווים. נהלים אלה מכוונים לסטנדרטיזציה של פרקטיקות ברחבי Xenopus של מין, גיל ומצב בריאותי שונים, במיוחד X. laevis ו- X. tropicalis.

Introduction

זילוח הגוף כולו של דו-חיים מתבצע באופן שגרתי לצורך שימור וקיבוע 1,2,3,4,5,6. עם זאת, הליכים אלה מתרחשים בקצב המגביל את מספר הדגימות הטריות שניתן לקחת לכל חיה. מטרת עבודה זו היא לפתח פרוטוקול זילוח דם יעיל בקסנופוס, תוך מתן עדיפות למהירות הטכניקה. הפרוטוקול לוקח פחות מ-10 דקות לכל חיה עבור X. tropicalis ופחות מ-15 דקות לכל X. laevis חיה. סדרי העדיפויות המשניים הם קלות השכפול והשימוש בציוד שנרכש בקלות, כך שניתן יהיה לשתף דגימות באיכות גבוהה באופן נרחב בין מעבדות Xenopus.

צפרדעי קסנופוס נמצאות בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים בסיסיים שנשמרו בין מינים. לטטרפוד זה יש קשר אבולוציוני קרוב יותר עם יונקים מאשר מודלים ימיים אחרים, ויש לו ריאות, לב בעל שלושה חדרים וגפיים עם ספרות. הקהילה הבינלאומית משתמשת ביעילות ב- Xenopus כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מחלות אנושיות באמצעות מודלים מעמיקים של מחלות וניתוח מולקולרי של תפקוד גנים הקשורים למחלות. היתרונות הרבים של קסנופוס כמודל של בעלי חיים הופכים אותם לכלים יקרי ערך לחקר הבסיס המולקולרי של התפתחות אנושית ומחלות; יתרונות אלה כוללים: גודל ביציות ועובר גדול, פריון גבוה, קלות דיור, התפתחות חיצונית מהירה וקלות מניפולציה גנומית. ההערכה היא כי Xenopus חולקים ~80% מהגנים המזוהים של המחלה האנושית⁷.

בהשוואה למודלים פופולריים של יונקים, Xenopus הוא מודל מהיר וחסכוני, עם קלות של הפלת מורפולינו וזמינות של טרנסגניות יעילות ומוטציות גנטיות ממוקדות באמצעות CRISPR⁸. ספקטרומטריית מסה כמותית ושעתוק חד-תאי יושמו בהצלחה על עוברי Xenopus^9,10, אך אטלס תאים עדכני של Xenopus laevis מראה כי הרכב רוב הרקמות נשלט על ידי סוגי תאי דם ¹¹. על ידי פיתוח טכניקה המשחררת רקמות בקצב מהיר ושימוש במדיה צוננת, טריות הדגימה מושפעת באופן מינימלי מזילוח. זה חשוב במיוחד עבור יישומים שבהם המטרה היא פרופיל mRNA או ביטוי חלבון שאינם מוטרדים פיזיולוגית.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של בית הספר לרפואה של הרווארד IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) (IS 00001365_3).

הערה: למרות שהשיטה העיקרית של המתת חסד המתוארת נחשבת לטכניקה מקובלת להמתת חסד על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית¹², היא לא נמצאה כמובילה להפסקת פעימות לב¹³. גם השיטה המשנית הנפוצה של פיטום כפול אינה מונעת זאת, וגם לא הוצאת הלב מהחיה. גירוש בעלי חיים מורדמים נחשב לשיטה הומנית ויעילה להמתת חסד מוצלחת¹². מכיוון ששמירה על רקמות טריות באמצעות המתת חסד היא המטרה של פרוטוקול זה, מועיל שהלב ימשיך לפעום באמצעות המתת חסד ראשונית עם MS-222, וכי זילוח הוא עצמו שיטת המתת חסד משנית באמצעות המתת חסד.

1. הכנה

1. ודא שמוסד המחקר אישר את טכניקת המתת החסד והזילוח המתוארת בפרוטוקול זה.
2. הכינו תמיסה של 5 גרם/ליטר MS-222 (טריקאין מתאן-סולפונט) ו-5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט. הנפח צריך להיות גדול יותר מהנפח הדרוש כדי לכסות לחלוטין את בעלי החיים המורדמים. בדוק את ה- pH כדי לוודא שהוא ≥7.
3. הכינו 500 μL של 180 U/mL הפרין במי מלח חוצצי פוספט (PBS) לכל X. laevis, או 200 μL לכל X. tropicalis.
4. לבצע המתת חסד ראשונית על ידי הצבת Xenopus בתמיסה זו (משלב 1.2); החיה תישאר שקועה במשך שעה אחת בסך הכל.
5. אשר כי Xenopus איבד את תגובת הכאב שלו על ידי צביטת כף הרגל 15 דקות לתוך המתת חסד. אם בעל החיים מגיב, להחזיר אותו לפתרון המתת חסד עד תגובה זו אובדת.
6. לשקול את Xenopus ולקחת את כל המדידות הנוספות הנדרשות לפני הדגימה.
7. באמצעות מחט 31 G, להזריק X. laevis עם 250 μL ו X. tropicalis עם 100 μL של 180 U/mL הפרין ב PBS (משלב 1.3) לתוך השרירים של כל גפה קדמית.
8. הכינו תמיסה של 1 מ"ל/גרם ממשקל בעלי החיים של 54 U/mL הפרין ב-PBS perfusate. אנשים מנוסים יותר עם פרוטוקול זה עשויים לגלות כי פחות מדיה נדרשת כדי להשלים זילוח.
9. השתמש במחט היפודרמית 22 G כדי לחורר X. laevis, ומחט היפודרמית 25 G עבור X. tropicali s. הקהו את מחט הזילוח על-ידי חיתוך הקצה באמצעות חותכי חוטים (איור 1)¹⁴.
   הערה: פעולה זו מפחיתה את הסבירות שהמחט תנקב דרך החדר אם היא מוזזת. בנוסף לקהות, המחט עשויה להיות טחונה מעט עם אבן השחזה או קובץ, אך עדיין להישאר חדה מספיק כדי לחדור את החדר.
10. הכינו את המשאבה על ידי חיבור המחט החתוכה ומחזור 54 U/mL פרפוזט PBS (משלב 1.8). הקפד לנקות את כל בועות האוויר מהצינור כדי למנוע את האפשרות של תסחיף אוויר, המוביל לירידה ביעילות הזילוח או לכשל (ראה טבלה 1). שמור את אמצעי הזלוף על קרח למשך ההליך.
11. אם המשאבה אינה ניתנת לתכנות, כאשר המחט במקומה, מדוד את נפח המדיה השאובה תחת ההגדרות השונות כדי לקבוע אילו הגדרות קרובות ביותר ל- 5 מ"ל לדקה ול- 10 מ"ל לדקה. קצבי זרימה אלה ישמשו ללא קשר למין. אם משאבת הזילוח ניתנת לתכנות, כייל אותה עם המחט במקומה, בהתאם להוראות היצרן.
12. הניחו את משטח הדיסקציה (מגש או יריעת קצף) בשיפוע בתוך מיכל משני, או סדרו אותו כדי להקל על ניקוז הדם.
13. לאחר שהצפרדע הייתה בתמיסה במשך שעה אחת, המתת חסד ראשונית הושלמה. הסר את הצפרדע ובדוק מחדש את תגובת אובדן הכאב על ידי ביצוע צביטה ברגל.
14. הניחו את הצפרדע על גבה ונעצו כל איבר (איור 2). אם נדרש שימור רקמת הגפיים, ניתן להניח סיכות דקות דרך הספרות או סיכות בצורת U סביב הגפיים.
15. בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך דרך העור, במעלה קו האמצע, ולאחר מכן לרוחב, עושה שני דשים. (איור 2)
16. השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את הלינאה אלבה ולמשוך אותה הרחק מהחלל הקואלומי (איור 3). בזהירות להשתמש מספריים לחתוך דרך השרירים. עשו שני דשים מקיר החלל וחתכו או נעצו את כל הדשים מהדרך.
17. השתמשו במספריים לדיסקציה כדי לחתוך דרך עצמות הקוראקואיד ולחתוך רקמה עודפת כדי לקבל גישה טובה יותר ללב (איור 3).
18. הלב עדיין צריך לפעום. אם הלב הפסיק לפעום לפני הזילוח, שימו לב שטריות הדגימה נפגעה.

2. זילוח

1. זהה את הבטן והזז אותה בעדינות כך שהיא נמצאת על גבי האונה השמאלית של הכבד (מימין לצופה), כאשר כלי הדם שלה גלויים למשך ההליך. זהה ריאה ואחז אותה בקצה שלה באמצעות מלקחיים רקמות. משכו את הריאה אל מחוץ לחלל הקואלומי ונעצו אותה דרך הקצה (איור 4). עשו זאת בעדינות, שכן כלי דם שבורים אינם מחוררים היטב. שים לב אם הדם גלוי בתוך האונה, שכן זה ישפיע על היכולת לקבוע את השלמת ההליך.
2. צלם תמונה של החלל הקואלומי כדי להעריך טוב יותר את יעילות הזילוח ואולי לזהות רקמות חריגות במועד מאוחר יותר.
3. זהו את קרום הלב הדק ומשכו אותו בעזרת מלקחיים רקמתיים (איור 5). בעדינות לנקב את קרום הלב באמצעות קצה מספריים iridectomy, נזהר לא לחתוך את הרקמות הבסיסיות. מקלפים את קרום הלב הרחק משלושת חדרי הלב.
4. השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החדר על ידי קודקודו. הפעילו לחץ מוגבל כך שיהיה מספיק מקום בין משטחי המתיחה של המלקחיים כדי שמחט הזילוח תעבור (איור 6).
5. הכניסו את המחט דרך סגירת המלקחיים לחדר החדר, תוך זהירות שלא לנקב דרך החדר (איור 7). מהדקים את מלקחיים הרקמה למקומם באמצעות מחזיק מחט באמצעות המוסטט.
   הערה: טכניקה זו מייצבת את מיקום המחט, שהוא עדיין חד. הצמדת המחט ישירות לחדר תגרום גם היא לנזק מיותר, מה שיקשה על הידוק במקרה הצורך (ראה טבלה 1).
6. התחל את זרימת המשאבה במהירות של כ- 5 מ"ל/דקה. שלושת חדרי הלב ותא המטען העורקי יתחרתו (איור 8; ראו טבלה 1).
7. עם מספריים, בזהירות lance את auricle ימין (בצד שמאל של הצופה); דם יישפך החוצה. הגדר את קצב הזרימה ל- 5 מ"ל לדקה או הגדל אותו ל- 10 מ"ל לדקה.
8. המשיכו עד שכלי הדם של הקיבה מתכווצים (ראו טבלה 1), ואז השוו את הפיתול השמאלי של הלב (מימין לצופה). אם קצב הזרימה הוא עדיין 5 מ"ל/דקה, הגדל אותו לכ-10 מ"ל/דקה.
9. השתמש פיפטה העברה כדי לשטוף את החלל coelomic במדיה זילוח, כדי לעזור לשמור על הראות כדי להעריך טוב יותר את הצבע של perfusate זורם מן auricles.
10. שמור את המחט במקומה עד שהשקע הזורם מהאוריקלס ברור (ראה טבלה 1) והריאה איבדה את גוונה האדום (ראה טבלה 1; איור 9).

תוצאות

לאחר זילוח מוצלח, כל הרקמות (למעט הכבד בקסנופוס פיגמנטי) יהיו קלות יותר באופן מובהק ורוויות פחות בדם. כלי דם עיקריים יהיו פחות בולטים (איור 10), ורקמות (למעט הכבד) יישטפו בצורה נקייה במאגר לאחר הדגימה. בעוד שביצוע מוצלח של הפרוטוקול יכול בסופו של דבר להיות מאושר רק על ידי ?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר טכניקות דיסקציה מסורתיות לגישה לחלל הקואלומי. טכניקות אחרות מקובלות גם כן, בתנאי שהן גורמות נזק מינימלי לרקמות, הלב נגיש, והריאה והקיבה גלויים. באופן דומה, ניתן להחליף בקלות את רוב כלי הדיסקציה המפורטים בפריטים דומים.

בעוד שנעשו ניסיונות לייעל את היעילות של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP