Perfusion sanguine rapide efficace chez Xenopus

Résumé

Un protocole efficace de perfusion sanguine rapide est présenté ici pour préparer des échantillons de tissus de grenouilles à griffes africaines pour des études transcriptomiques et protéomiques.

Résumé

Les Xénopes sont de puissants organismes modèles pour comprendre le développement des vertébrés et les maladies depuis plus de 100 ans. Ici, un protocole de perfusion sanguine rapide dans Xenopus, visant à une réduction cohérente et drastique du sang dans tous les tissus, est défini. La perfusion est réalisée en insérant une aiguille directement dans le ventricule du cœur et en pompant une solution saline héparinée tamponnée au phosphate (PBS) à travers le système vasculaire. La procédure peut être complétée en environ 10 minutes par animal. Le sang est dominé par quelques protéines et types de cellules très abondants, créant de nombreux problèmes car ces protéines masquent la plupart des autres molécules et types de cellules d’intérêt. La caractérisation reproductible des tissus Xenopus adultes avec la protéomique quantitative et la transcriptomique unicellulaire bénéficiera de l’application de ce protocole avant l’échantillonnage d’organes. Les protocoles d’échantillonnage tissulaire sont définis dans des documents d’accompagnement. Ces procédures visent à normaliser les pratiques chez Xenopus de sexe, d’âge et d’état de santé différents, en particulier X. laevis et X. tropicalis.

Introduction

La perfusion du corps entier des amphibiens est systématiquement complétée à des fins de préservation et de fixation 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces procédures se produisent à un rythme qui limite le nombre d’échantillons frais qui peuvent être prélevés par animal. Le but de ce travail est de développer un protocole de perfusion sanguine efficace chez Xenopus, en priorisant la vitesse de la technique. Le protocole prend moins de 10 minutes par animal pour X. tropicalis et moins de 15 minutes par animal X. laevis. Les priorités secondaires sont la facilité de réplication et l’utilisation d’équipements faciles à acquérir afin que des échantillons de haute qualité puissent être largement partagés entre les laboratoires Xenopus.

Les grenouilles Xenopus sont largement utilisées dans la recherche biomédicale pour étudier les processus biologiques et pathologiques fondamentaux conservés entre les espèces. Ce tétrapode a une relation évolutive plus étroite avec les mammifères que les autres modèles aquatiques, ayant des poumons, un cœur à trois chambres et des membres avec des doigts. La communauté internationale utilise efficacement Xenopus pour mieux comprendre les maladies humaines grâce à une modélisation approfondie des maladies et à une analyse moléculaire de la fonction des gènes liés à la maladie. Les nombreux avantages de Xenopus en tant que modèle animal en font des outils précieux pour étudier la base moléculaire du développement humain et de la maladie; Ces avantages comprennent : une grande taille d’ovocytes et d’embryons, une fécondité élevée, une facilité de logement, un développement externe rapide et une facilité de manipulation génomique. On estime que Xenopus partage ~80% des gènes de maladies humaines identifiés⁷.

Comparé aux modèles de mammifères populaires, Xenopus est un modèle rapide et rentable, avec la facilité d’élimination du morpholino et la disponibilité de transgéniques efficaces et de mutations génétiques ciblées à l’aide de CRISPR⁸. La spectrométrie de masse quantitative et la transcriptomique unicellulaire ont été appliquées avec succès aux embryons Xenopus^9,10, mais un atlas cellulaire récent de Xenopus laevis montre que la composition de la plupart des tissus est dominée par les types de cellules sanguines ¹¹. En développant une technique qui exsanguine les tissus à un rythme rapide et en utilisant des milieux réfrigérés, la fraîcheur de l’échantillon est peu affectée par la perfusion. Ceci est particulièrement important pour les applications où l’objectif est de profiler l’expression physiologiquement non perturbée de l’ARNm ou de la protéine.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux règles et règlements de la Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

REMARQUE : Bien que la principale méthode d’euthanasie décrite soit considérée comme une technique acceptable pour l’euthanasie par l’American Veterinary Medical Association¹², il n’a pas été constaté qu’elle entraînait l’arrêt d’un battement de cœur¹³. Même la méthode secondaire fréquemment utilisée de double pithing n’empêche pas cela, pas plus que le retrait du cœur de l’animal. L’exsanguination des animaux anesthésiés est considérée comme une méthode humaine et efficace pour une euthanasie réussie¹². Comme le maintien de tissus frais par euthanasie est l’objectif de ce protocole, il est bénéfique que le cœur continue de battre pendant l’euthanasie primaire avec MS-222, et que la perfusion soit elle-même une méthode d’euthanasie secondaire par exsanguination.

1. Préparation

1. S’assurer que l’établissement de recherche a approuvé la technique d’euthanasie et de perfusion décrite dans le présent protocole.
2. Préparer une solution de 5 g/L de MS-222 (méthanesulfonate de tricaïne) et de 5 g/L de bicarbonate de sodium. Le volume doit être supérieur au volume requis pour couvrir complètement les animaux euthanasiés. Vérifiez le pH pour vous assurer qu’il est ≥7.
3. Préparer 500 μL d’héparine 180 U/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par X. laevis ou 200 μL par X. tropicalis.
4. Effectuer l’euthanasie primaire en plaçant le Xenopus dans cette solution (à partir de l’étape 1.2); L’animal restera immergé pendant un total de 1 h.
5. Confirmer que le Xenopus a perdu sa réponse à la douleur en pinçant le pied 15 minutes dans l’euthanasie. Si l’animal est réactif, remettez-le dans la solution d’euthanasie jusqu’à ce que cette réponse soit perdue.
6. Peser le Xenopus et prendre toutes les mesures supplémentaires requises avant l’échantillonnage.
7. À l’aide d’une aiguille de 31 G, injecter 250 μL à X. laevis et X . tropicalis 100 μL d’héparine à 180 U/mL dans du PBS (à partir de l’étape 1.3) dans la musculature de chaque membre antérieur.
8. Préparer une solution de 1 mL/g du poids animal de 54 U/mL d’héparine dans du perfusat PBS. Les personnes plus expérimentées avec ce protocole peuvent constater que moins de milieu est nécessaire pour compléter la perfusion.
9. Utilisez une aiguille hypodermique de 22 G pour perfuser X. laevis et une aiguille hypodermique de 25 G pour X. tropicali s. Émoussez l’aiguille de perfusion en coupant l’extrémité à l’aide de coupe-fil (figure 1)¹⁴.
   REMARQUE: Cela réduit la probabilité que l’aiguille perfore à travers le ventricule si elle est déplacée. En plus de s’émousser, l’aiguille peut être légèrement broyée avec une pierre à aiguiser ou une lime, mais rester suffisamment tranchante pour percer le ventricule.
10. Préparer la pompe en fixant l’aiguille parée et en faisant circuler 54 U/mL de PBS hépariné perfusé (à partir de l’étape 1.8). Assurez-vous de purger toutes les bulles d’air du tube pour éliminer la possibilité d’embolie gazeuse, ce qui entraîne une diminution de l’efficacité ou une défaillance de la perfusion (voir le tableau 1). Gardez le milieu de perfusion sur la glace pendant toute la durée de la procédure.
11. Si la pompe n’est pas programmable, avec l’aiguille en place, mesurez le volume de fluide pompé sous les différents réglages pour déterminer quels réglages sont les plus proches de 5 mL/min et 10 mL/min. Ces débits seront utilisés quelle que soit l’espèce. Si la pompe de perfusion est programmable, étalonnez-la avec l’aiguille en place, en suivant les instructions du fabricant.
12. Placez la surface de dissection (plateau ou feuille de mousse) inclinée dans un contenant secondaire ou disposez-la de manière à faciliter le drainage du sang.
13. Une fois que la grenouille a été dans la solution pendant 1 h, l’euthanasie primaire a été complétée. Retirez la grenouille et revérifiez la perte de réponse à la douleur en effectuant un pincement du pied.
14. Placez la grenouille sur le dos et épinglez chaque membre (figure 2). Si la préservation du tissu des membres est nécessaire, de fines broches peuvent être placées à travers les doigts ou des agrafes en forme de U autour des membres.
15. À l’aide de ciseaux à dissection, couper à travers la peau, remonter la ligne médiane, puis latéralement, en faisant deux volets. (Figure 2)
16. Utilisez une pince pour saisir la linea alba et l’éloigner de la cavité cœlomique (Figure 3). Utilisez soigneusement des ciseaux pour couper à travers la musculature. Faites deux rabats hors de la paroi de la cavité et coupez ou épinglez tous les rabats hors du chemin.
17. Utilisez des ciseaux à dissection pour découper les os coracoïdes et couper l’excès de tissu pour obtenir un meilleur accès au cœur (Figure 3).
18. Le cœur devrait encore battre. Si le cœur a cessé de battre avant la perfusion, notez que la fraîcheur de l’échantillon a été compromise.

2. Perfusion

1. Identifiez l’estomac et déplacez-le doucement de sorte qu’il soit au-dessus du lobe gauche du foie (à droite du spectateur), avec son système vasculaire visible pendant toute la durée de la procédure. Identifiez un poumon et saisissez-le par son extrémité à l’aide d’une pince à tissus. Tirez le poumon à l’extérieur de la cavité cœlomique et épinglez-le à travers l’extrémité (Figure 4). Faites-le doucement, car les vaisseaux sanguins brisés ne perfusent pas bien. Notez si du sang est visible dans le lobe, car cela affectera la capacité de déterminer l’achèvement de la procédure.
2. Prenez une image de la cavité cœlomique pour mieux évaluer l’efficacité de la perfusion et potentiellement identifier les tissus anormaux à une date ultérieure.
3. Identifiez le péricarde mince et tirez-le à l’aide d’une pince tissulaire (Figure 5). Perforez doucement le péricarde à l’aide de la pointe des ciseaux d’iridectomie, en prenant soin de ne pas couper les tissus sous-jacents. Retirez le péricarde des trois cavités du cœur.
4. Utilisez une pince pour saisir doucement le ventricule par son sommet. Appliquez une pression limitée de manière à ce qu’il y ait suffisamment d’espace entre les surfaces de traction des pinces pour que l’aiguille de perfusion puisse passer (Figure 6).
5. Insérez l’aiguille à travers la fermeture de la pince dans la chambre du ventricule, en prenant soin de ne pas perforer à travers le ventricule (Figure 7). Serrez les pinces tissulaires en place à l’aide d’un porte-aiguille à l’aide d’un hémostatique.
   NOTE: Cette technique stabilise la position de l’aiguille, qui est encore tranchante. Le serrage de l’aiguille directement sur le ventricule causera également des dommages inutiles, ce qui rendra la récupération plus difficile si nécessaire (voir le tableau 1).
6. Démarrez le débit de la pompe à environ 5 mL/min. Les trois cavités du cœur et du tronc artériel s’engorgeront (Figure 8; voir tableau 1).
7. Avec des ciseaux, lancez soigneusement l’oreillette droite (à gauche du spectateur); Le sang coulera. Réglez le débit à 5 mL/min ou augmentez-le à 10 mL/min.
8. Continuez jusqu’à ce que le système vasculaire de l’estomac blanchisse (voir tableau 1), puis lancez l’oreillette gauche du cœur (à droite du spectateur). Si le débit est toujours de 5 mL/min, augmentez-le à environ 10 mL/min.
9. Utilisez une pipette de transfert pour rincer la cavité cœlomique dans un milieu de perfusion, pour aider à maintenir la visibilité et pour mieux évaluer la couleur du perfusat qui s’écoule des oreillettes.
10. Gardez l’aiguille en place jusqu’à ce que le perfusat qui s’écoule des oreillettes soit clair (voir le tableau 1) et que le poumon ait perdu sa teinte rouge (voir le tableau 1; Graphique 9).

Résultats

Après une perfusion réussie, tous les tissus (à l’exception du foie dans Xenopus pigmenté) seront nettement plus légers et moins saturés de sang. Les principaux vaisseaux sanguins deviendront moins visibles (figure 10) et les tissus (à l’exclusion du foie) se rinceront proprement dans le tampon après avoir été échantillonnés. Bien que la réussite de l’exécution du protocole ne puisse finalement être confirmée que par la qualité des données provenant d’écha...

Discussion

Ce protocole décrit les techniques de dissection traditionnelles pour accéder à la cavité cœlomique. D’autres techniques sont également acceptables, à condition qu’elles causent des dommages minimes aux tissus, que le cœur soit accessible et que les poumons et l’estomac soient visibles. De même, la plupart des outils de dissection énumérés peuvent être facilement remplacés par des éléments comparables.

Bien que des tentatives aient été faites pour optimiser l’efficaci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP