Xenopus의 효과적인 급속 관류

요약

여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.

초록

제노푸스는 100년 넘게 척추동물의 발달과 질병을 이해하는 강력한 모델 유기체였습니다. 여기에서는 모든 조직 내에서 일관되고 과감한 혈액 감소를 목표로 하는 Xenopus의 신속한 혈액 관류 프로토콜이 정의됩니다. 관류는 바늘을 심장의 심실에 직접 삽입하고 혈관계를 통해 헤파린 화 인산염 완충 식염수 (PBS)를 펌핑하여 수행됩니다. 절차는 동물 당 약 10 분 안에 완료 할 수 있습니다. 혈액은 몇 가지 매우 풍부한 단백질과 세포 유형에 의해 지배되며, 이러한 단백질이 대부분의 다른 분자와 관심 세포 유형을 가리기 때문에 수많은 문제를 야기합니다. 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학을 사용한 성인 Xenopus 조직의 재현 가능한 특성화는 장기 샘플링 전에 이 프로토콜을 적용함으로써 이점을 얻을 수 있습니다. 조직 샘플링을 위한 프로토콜은 동반 논문에 정의되어 있습니다. 이 절차는 성별, 연령 및 건강 상태가 다른 Xenopus, 특히 X. laevis 및 X. tropicalis의 관행을 표준화하는 것을 목표로합니다.

서문

양서류의 전신 관류는 보존과 고정을 위해 일상적으로 이루어진다 1,2,3,4,5,6. 그러나 이러한 절차는 동물당 채취할 수 있는 신선한 샘플의 수를 제한하는 속도로 발생합니다. 이 연구의 목표는 Xenopus에서 효과적인 혈액 관류 프로토콜을 개발하여 기술의 속도를 우선시하는 것입니다. 이 프로토콜은 X. tropicalis의 경우 동물당 10분 미만, X. laevis 동물당 15분 미만이 소요됩니다. 두 번째 우선 순위는 복제의 용이성과 쉽게 획득할 수 있는 장비의 사용으로, 고품질 샘플을 Xenopus 실험실 간에 널리 공유할 수 있습니다.

Xenopus 개구리는 종에 걸쳐 보존된 기본적인 생물학적 및 병리학적 과정을 연구하기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 이 네발 동물은 다른 수생 모델보다 포....

프로토콜

모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행하였다.

참고: 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)는 안락사의 일차적인 방법이 안락사에 대해 받아들일 수 있는 것으로 간주되지만¹², 심장 박동을 멈추게 하는 것으로 밝혀지지는 않았다¹³. 자주 사용되는 이중 pithing의 2 차 방법조차도 이것을 막지 못하며 동물에게서 심장을 제거하지도 않습니다. 마취된 동물의 방혈은 성공적인 안락사를 위한 인도적이고 효과적인 방법으로 간주된다¹². 안락사를 통해 신선한 조직을 유지하는 것이 이 프로토콜의 목표이기 때문에 MS-222를 사용한 1차 안락사를 통해 심장이 계속 뛰는 것이 유익하며, 관류 자체가 방혈을 통한 2차 안락사 방법입니다.

1. 준비

1. 연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 및 관류 기술을 승인했는지 확인합니다.
2. 5g/....

토론

이 프로토콜은 체강에 접근하기 위한 전통적인 해부 기술을 설명합니다. 조직에 최소한의 손상을 입히고 심장에 접근 할 수 있으며 폐와 위가 보이는 경우 다른 기술도 허용됩니다. 마찬가지로, 나열된 대부분의 해부 도구는 유사한 항목으로 쉽게 대체할 수 있습니다.

이 절차의 효능을 최적화하기 위한 시도가 있었지만 결과는 개인의 경험과 개별 개구리 간의 가변성에 따라.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP