Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.

Resumo

Xenopus têm sido poderosos organismos modelo para entender o desenvolvimento de vertebrados e doenças por mais de 100 anos. Aqui, um protocolo de perfusão sanguínea rápida em Xenopus, visando uma redução consistente e drástica do sangue dentro de todos os tecidos, é definido. A perfusão é realizada inserindo uma agulha diretamente no ventrículo do coração e bombeando solução salina tamponada com fosfato heparinizado (PBS) através do sistema vascular. O procedimento pode ser concluído em aproximadamente 10 min por animal. O sangue é dominado por algumas proteínas e tipos celulares altamente abundantes, criando inúmeros problemas, pois essas proteínas mascaram a maioria das outras moléculas e tipos celulares de interesse. A caracterização reprodutível de tecidos adultos de Xenopus com proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única se beneficiará da aplicação deste protocolo antes da amostragem de órgãos. Os protocolos para amostragem de tecidos são definidos em artigos complementares. Esses procedimentos visam à padronização de práticas entre Xenopus de diferentes sexos, idades e estados de saúde, especificamente X. laevis e X. tropicalis.

Introdução

A perfusão de corpo inteiro dos anfíbios é rotineiramente completada para fins de preservação e fixação 1,2,3,4,5,6. No entanto, esses procedimentos ocorrem a uma taxa que limita o número de amostras frescas que podem ser coletadas por animal. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo de perfusão sanguínea efetivo em Xenopus, priorizando a velocidade da técnica. O protocolo leva menos de 10 min por animal para X. tropicalis e menos de 15 min por animal X. laevis. As prioridades secundárias são a facilidade de replicação e o uso de equipamentos de fácil aquisição para que amostras de alta qualidade possam ser amplamente compartilhadas entre os laboratórios Xenopus.

As rãs Xenopus são amplamente utilizadas em pesquisas biomédicas para estudar processos biológicos e patológicos fundamentais conservados entre espécies. Este tetrápode tem uma relação evolutiva mais próxima com os mamíferos do que outros modelos aquáticos, tendo pulmões, um coração de três câmaras e membros com dedos. A comunidade internacional usa efetivamente o Xenopus para obter uma compreensão mais profunda da doença humana por meio de modelagem profunda da doença e análise molecular da função gênica relacionada à doença. As inúmeras vantagens do Xenopus como modelo animal os tornam ferramentas inestimáveis para estudar as bases moleculares do desenvolvimento humano e das doenças; Essas vantagens incluem: grande tamanho do ovócito e do embrião, alta fecundidade, facilidade de alojamento, rápido desenvolvimento externo e facilidade de manipulação genômica. Estima-se que o Xenopus compartilhe ~80% dos genes de doenças humanas identificados⁷.

Em comparação com modelos populares de mamíferos, o Xenopus é um modelo rápido e econômico, com a facilidade de knock-down de morfolinos e disponibilidade de transgênicos eficientes e mutações gênicas direcionadas usando CRISPR⁸. A espectrometria quantitativa de massas e a transcriptômica unicelular têm sido aplicadas com sucesso em embriões de Xenopus^9,10, mas um atlas celular recente de Xenopus laevis mostra que a composição da maioria dos tecidos é dominada pelos tipos de células sanguíneas ¹¹. Ao desenvolver uma técnica que exsanguina o tecido em um ritmo rápido e usando meios refrigerados, o frescor da amostra é minimamente afetado pela perfusão. Isso é particularmente importante para aplicações onde o objetivo é traçar o perfil fisiologicamente não perturbado do RNAm ou da expressão de proteínas.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

NOTA: Embora o método primário de eutanásia descrito seja considerado uma técnica aceitável para eutanásia pela Associação Médica Veterinária^{Americana 12}, não foi encontrado que levasse à cessação de um batimento cardíaco¹³. Mesmo o método secundário frequentemente usado de pithing duplo não impede isso, nem remove o coração do animal. A exsanguinação de animais anestesiados é considerada um método humano e eficaz para o sucesso da eutanásia¹². Como a manutenção de tecidos frescos através da eutanásia é o objetivo deste protocolo, é benéfico que o coração continue a bater através da eutanásia primária com MS-222, e que a perfusão seja em si um método de eutanásia secundária através da exsanguinação.

1. Preparo

1. Certificar-se de que a instituição de pesquisa aprovou a técnica de eutanásia e perfusão descrita neste protocolo.
2. Preparar uma solução de 5 g/L MS-222 (metanossulfonato de tricaina) e 5 g/L de bicarbonato de sódio. O volume deve ser maior do que o volume necessário para cobrir completamente os animais a serem eutanasiados. Verifique o pH para garantir que está ≥7.
3. Preparar 500 μL de 180 U/mL de heparina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por X. laevis, ou 200 μL por X. tropicalis.
4. Realizar a eutanásia primária colocando o Xenopus nesta solução (a partir do passo 1.2); O animal permanecerá submerso por um total de 1 h.
5. Confirme que o Xenopus perdeu sua resposta de dor ao beliscar o pé 15 minutos após a eutanásia. Se o animal for reativo, devolva-o à solução de eutanásia até que essa resposta seja perdida.
6. Pese o Xenopus e faça todas as medições adicionais necessárias antes da amostragem.
7. Com uma agulha de 31 G, injetar X. laevis com 250 μL e X. tropicalis com 100 μL de 180 U/mL de heparina em PBS (a partir do passo 1.3) na musculatura de cada membro torácico.
8. Preparar uma solução de 1 mL/g do peso do animal de 54 U/mL de heparina em perfusato de PBS. Indivíduos mais experientes com esse protocolo podem achar que menos meios são necessários para completar a perfusão.
9. Use uma agulha hipodérmica 22 G para perfundir X. laevis e uma agulha hipodérmica 25 G para X. tropicali s. Embotar a agulha de perfusão aparando a ponta com cortadores de arame (Figura 1)¹⁴.
   NOTA: Isso reduz a probabilidade de a agulha perfurar através do ventrículo se deslocada. Além de embotar, a agulha pode ser ligeiramente moída com uma pedra afiada ou lima, mas ainda permanecendo afiada o suficiente para perfurar o ventrículo.
10. Preparar a bomba ligando a agulha aparada e circulando 54 U/mL de perfusato de PBS heparinizado (a partir do passo 1.8). Certifique-se de purgar todas as bolhas de ar da tubulação para eliminar a possibilidade de embolia gasosa, o que leva à diminuição da eficiência ou falha da perfusão (ver Tabela 1). Manter o meio de perfusão no gelo durante todo o procedimento.
11. Se a bomba não for programável, com a agulha no lugar, meça o volume bombeado do meio sob as diferentes configurações para determinar quais configurações estão mais próximas de 5 mL/min e 10 mL/min. Estes caudais serão utilizados independentemente da espécie. Se a bomba de perfusão for programável, calibre-a com a agulha no lugar, seguindo as instruções do fabricante.
12. Coloque a superfície de dissecção (bandeja ou folha de espuma) em uma inclinação dentro de um recipiente secundário ou arranje-a para facilitar a drenagem do sangue.
13. Uma vez que a rã tenha estado na solução por 1 h, a eutanásia primária foi concluída. Remova a rã e verifique novamente a perda de resposta à dor realizando uma pinça no pé.
14. Coloque a rã de costas e fixe cada membro (Figura 2). Se for necessário preservar o tecido dos membros, pinos finos podem ser colocados através dos dedos ou grampos em forma de U ao redor dos membros.
15. Com tesoura de dissecção, corte a pele, suba a linha média e depois lateralmente, confeccionando dois retalhos. (Gráfico 2)
16. Use pinça para agarrar a linha alba e puxá-la para longe da cavidade celômica (Figura 3). Use cuidadosamente a tesoura para cortar a musculatura. Faça dois retalhos para fora da parede da cavidade e corte ou fixe todos os retalhos fora do caminho.
17. Utilizar tesoura de dissecção para cortar os ossos coracoide e cortar o excesso de tecido para melhor acesso ao coração (Figura 3).
18. O coração ainda deve estar batendo. Se o coração parou de bater antes da perfusão, observe que o frescor da amostra foi comprometido.

2. Perfusão

1. Identifique o estômago e desloque-o suavemente para que fique em cima do lobo esquerdo do fígado (à direita do observador), com sua vasculatura visível durante o procedimento. Identifique um pulmão e segure-o por sua ponta usando pinças de tecido. Puxar o pulmão para fora da cavidade celômica e fixá-lo através da ponta (Figura 4). Faça isso suavemente, pois os vasos sanguíneos quebrados não perfundem bem. Observe se o sangue é visível dentro do lóbulo, pois isso afetará a capacidade de determinar a conclusão do procedimento.
2. Tire uma imagem da cavidade celômica para avaliar melhor a eficiência da perfusão e potencialmente identificar tecidos anormais em uma data posterior.
3. Identificar o pericárdio fino e tracioná-lo com pinça de tecido (Figura 5). Perfurar suavemente o pericárdio usando a ponta da tesoura de iridectomia, tomando cuidado para não cortar os tecidos subjacentes. Descasque o pericárdio para longe das três câmaras do coração.
4. Use pinças para segurar suavemente o ventrículo pelo seu ápice. Aplicar pressão limitada para que haja espaço suficiente entre as superfícies de tração da pinça para a passagem da agulha de perfusão (Figura 6).
5. Inserir a agulha através do fechamento da pinça na câmara do ventrículo, tomando cuidado para não perfurar através do ventrículo (Figura 7). Aperte a pinça de tecido no lugar usando um suporte de agulha usando um hemostático.
   NOTA: Esta técnica estabiliza a posição da agulha, que ainda está afiada. O pinçamento da agulha diretamente no ventrículo também causará danos desnecessários, dificultando a recuperação caso seja necessário (ver Tabela 1).
6. Iniciar o fluxo da bomba em aproximadamente 5 mL/min. As três câmaras do coração e do tronco arterial irão ingurgitar (Figura 8; ver Tabela 1).
7. Com tesoura, lance cuidadosamente a aurícula direita (à esquerda do espectador); sangue derramará. Ajuste o fluxo em 5 mL/min ou aumente-o para 10 mL/min.
8. Continue até que a vasculatura do estômago se abra (ver Tabela 1), depois lance a aurícula esquerda do coração (à direita do espectador). Se o fluxo ainda for de 5 mL/min, aumente-o para aproximadamente 10 mL/min.
9. Use uma pipeta de transferência para enxaguar a cavidade celômica em meios de perfusão, para ajudar a manter a visibilidade e avaliar melhor a cor do perfusato que flui das aurículas.
10. Manter a agulha no lugar até que o perfusato que flui das aurículas esteja claro (ver Tabela 1) e o pulmão tenha perdido sua tonalidade vermelha (ver Tabela 1; Gráfico 9).

Resultados

Após uma perfusão bem-sucedida, todos os tecidos (excluindo o fígado em Xenopus pigmentado) serão nitidamente mais leves e menos saturados de sangue. Os principais vasos sanguíneos tornar-se-ão menos perceptíveis (Figura 10), e os tecidos (excluindo o fígado) serão enxaguados de forma limpa no tampão após a amostragem. Embora a execução bem-sucedida do protocolo só possa ser confirmada pela qualidade dos dados das amostras de tecido exsangüinado, vários problemas tí...

Discussão

Este protocolo descreve as técnicas tradicionais de dissecção para acesso à cavidade celômica. Outras técnicas também são aceitáveis, desde que causem danos mínimos aos tecidos, o coração seja acessível e o pulmão e o estômago sejam visíveis. Da mesma forma, a maioria das ferramentas de dissecção listadas pode ser facilmente substituída por itens comparáveis.

Embora tenham sido feitas tentativas para otimizar a eficácia desse procedimento, os resultados podem variar depend...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP