Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.

Resumo

Xenopus têm sido poderosos organismos modelo para entender o desenvolvimento de vertebrados e doenças por mais de 100 anos. Aqui, um protocolo de perfusão sanguínea rápida em Xenopus, visando uma redução consistente e drástica do sangue dentro de todos os tecidos, é definido. A perfusão é realizada inserindo uma agulha diretamente no ventrículo do coração e bombeando solução salina tamponada com fosfato heparinizado (PBS) através do sistema vascular. O procedimento pode ser concluído em aproximadamente 10 min por animal. O sangue é dominado por algumas proteínas e tipos celulares altamente abundantes, criando inúmeros problemas, pois essas proteínas mascaram a maioria das outras moléculas e tipos celulares de interesse. A caracterização reprodutível de tecidos adultos de Xenopus com proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única se beneficiará da aplicação deste protocolo antes da amostragem de órgãos. Os protocolos para amostragem de tecidos são definidos em artigos complementares. Esses procedimentos visam à padronização de práticas entre Xenopus de diferentes sexos, idades e estados de saúde, especificamente X. laevis e X. tropicalis.

Introdução

A perfusão de corpo inteiro dos anfíbios é rotineiramente completada para fins de preservação e fixação 1,2,3,4,5,6. No entanto, esses procedimentos ocorrem a uma taxa que limita o número de amostras frescas que podem ser coletadas por animal. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo de perfusão sanguínea efetivo em Xenopus, priorizando a velocidade da técnica. O protocolo leva menos de 10 min por animal para X. tropicalis e menos de 15 min po....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

NOTA: Embora o método primário de eutanásia descrito seja considerado uma técnica aceitável para eutanásia pela Associação Médica Veterinária^{Americana 12}, não foi encontrado que levasse à cessação de um batimento cardíaco¹³. Mesmo o método secundário frequentemente usado de pithing duplo não impede isso, nem remove o coração do animal. A exsanguinação de animais anestesiados é considerada um método humano e eficaz para o su....

Discussão

Este protocolo descreve as técnicas tradicionais de dissecção para acesso à cavidade celômica. Outras técnicas também são aceitáveis, desde que causem danos mínimos aos tecidos, o coração seja acessível e o pulmão e o estômago sejam visíveis. Da mesma forma, a maioria das ferramentas de dissecção listadas pode ser facilmente substituída por itens comparáveis.

Embora tenham sido feitas tentativas para otimizar a eficácia desse procedimento, os resultados podem variar depend.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP