Эффективная быстрая перфузия крови у Xenopus

Резюме

Здесь представлен эффективный протокол быстрой перфузии крови для подготовки образцов тканей африканских когтистых лягушек для исследований транскриптомики и протеомики.

Аннотация

Xenopus были мощными модельными организмами для понимания развития позвоночных и болезней на протяжении более 100 лет. Здесь определяется протокол быстрой перфузии крови в Xenopus, направленный на последовательное и резкое сокращение крови во всех тканях. Перфузия осуществляется путем введения иглы непосредственно в желудочек сердца и перекачивания гепаринизированного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) через сосудистую систему. Процедура может быть завершена примерно за 10 минут на животное. В крови преобладают несколько очень распространенных белков и типов клеток, что создает многочисленные проблемы, поскольку эти белки маскируют большинство других молекул и типов клеток, представляющих интерес. Воспроизводимая характеристика тканей взрослого Xenopus с помощью количественной протеомики и одноклеточной транскриптомики выиграет от применения этого протокола до отбора проб органов. Протоколы отбора проб тканей определены в сопроводительных документах. Эти процедуры направлены на стандартизацию практики Xenopus разного пола, возраста и состояния здоровья, в частности X. laevis и X. tropicalis.

Введение

Перфузия всего тела амфибий обычно завершается с целью сохранения и фиксации 1,2,3,4,5,6. Однако эти процедуры происходят со скоростью, которая ограничивает количество свежих образцов, которые могут быть взяты на одно животное. Целью данной работы является разработка эффективного протокола перфузии крови в Xenopus, отдавая приоритет скорости техники. Протокол занимает менее 10 минут на животное для X. tropicalis и менее 15 минут на животное X. laevis.....

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и положениями Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя основной метод эвтаназии, описанный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией, считается приемлемым методом эвтаназии¹², не было обнаружено, что он приводит к прекращению сердцебиения¹³. Даже часто используемый вторичный метод двойной порки не предотвращает этого, равно как и удаление сердца у животного. Обескровливание животных, находящихся под наркозом, считается гуманным и эффективным методом успешно....

Результаты

После успешной перфузии все ткани (за исключением печени у пигментированного ксенопуса) будут заметно светлее и менее насыщены кровью. Крупные кровеносные сосуды станут менее заметными (рис. 10), а ткани (за исключением печени) будут чисто промыты в буфере после отбо?.......

Обсуждение

Этот протокол описывает традиционные методы диссекции для доступа к целомической полости. Другие методы также приемлемы, при условии, что они наносят минимальный ущерб тканям, сердце доступно, а легкие и желудок видны. Точно так же большинство перечисленных инструментов вскрытия можн?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP