Эффективная быстрая перфузия крови у Xenopus

Резюме

Здесь представлен эффективный протокол быстрой перфузии крови для подготовки образцов тканей африканских когтистых лягушек для исследований транскриптомики и протеомики.

Аннотация

Xenopus были мощными модельными организмами для понимания развития позвоночных и болезней на протяжении более 100 лет. Здесь определяется протокол быстрой перфузии крови в Xenopus, направленный на последовательное и резкое сокращение крови во всех тканях. Перфузия осуществляется путем введения иглы непосредственно в желудочек сердца и перекачивания гепаринизированного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) через сосудистую систему. Процедура может быть завершена примерно за 10 минут на животное. В крови преобладают несколько очень распространенных белков и типов клеток, что создает многочисленные проблемы, поскольку эти белки маскируют большинство других молекул и типов клеток, представляющих интерес. Воспроизводимая характеристика тканей взрослого Xenopus с помощью количественной протеомики и одноклеточной транскриптомики выиграет от применения этого протокола до отбора проб органов. Протоколы отбора проб тканей определены в сопроводительных документах. Эти процедуры направлены на стандартизацию практики Xenopus разного пола, возраста и состояния здоровья, в частности X. laevis и X. tropicalis.

Введение

Перфузия всего тела амфибий обычно завершается с целью сохранения и фиксации 1,2,3,4,5,6. Однако эти процедуры происходят со скоростью, которая ограничивает количество свежих образцов, которые могут быть взяты на одно животное. Целью данной работы является разработка эффективного протокола перфузии крови в Xenopus, отдавая приоритет скорости техники. Протокол занимает менее 10 минут на животное для X. tropicalis и менее 15 минут на животное X. laevis. Второстепенными приоритетами являются простота репликации и использование легко приобретаемого оборудования, чтобы высококачественные образцы могли широко использоваться лабораториями Xenopus.

Лягушки Xenopus широко используются в биомедицинских исследованиях для изучения фундаментальных биологических и патологических процессов, сохраняющихся у разных видов. Этот четвероногий имеет более тесные эволюционные отношения с млекопитающими, чем другие водные модели, имея легкие, трехкамерное сердце и конечности с пальцами. Международное сообщество эффективно использует Xenopus для более глубокого понимания болезней человека посредством углубленного моделирования заболеваний и молекулярного анализа функции генов, связанных с болезнью. Многочисленные преимущества Xenopus в качестве животной модели делают их бесценными инструментами для изучения молекулярных основ развития и болезней человека; К таким преимуществам относятся: большой размер ооцитов и эмбрионов, высокая плодовитость, легкость размещения, быстрое внешнее развитие и простота геномных манипуляций. По оценкам, Xenopus разделяют ~ 80% идентифицированных генов болезней человека⁷.

По сравнению с популярными моделями млекопитающих, Xenopus является быстрой и экономически эффективной моделью, с легкостью нокдауна морфолино и наличием эффективных трансгенов и целевых мутаций генов с использованием CRISPR⁸. Количественная масс-спектрометрия и одноклеточная транскриптомика были успешно применены к эмбрионам Xenopus 9,10, но недавний клеточный атлас Xenopus laevis показывает^, что в составе большинства тканей преобладают типы клеток крови¹¹. Благодаря разработке метода, который обескровливает ткани с высокой скоростью и с использованием охлажденных сред, перфузия минимально влияет на свежесть образца. Это особенно важно для приложений, где цель состоит в том, чтобы профилировать физиологически невозмущенную экспрессию мРНК или белка.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и положениями Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя основной метод эвтаназии, описанный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией, считается приемлемым методом эвтаназии¹², не было обнаружено, что он приводит к прекращению сердцебиения¹³. Даже часто используемый вторичный метод двойной порки не предотвращает этого, равно как и удаление сердца у животного. Обескровливание животных, находящихся под наркозом, считается гуманным и эффективным методом успешной эвтаназии¹². Поскольку поддержание свежих тканей посредством эвтаназии является целью этого протокола, полезно, чтобы сердце продолжало биться во время первичной эвтаназии с MS-222, и что перфузия сама по себе является методом вторичной эвтаназии путем обескровливания.

1. Подготовка

1. Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило метод эвтаназии и перфузии, описанный в этом протоколе.
2. Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаинметансульфоната) и 5 г/л бикарбоната натрия. Объем должен быть больше, чем объем, необходимый для полного покрытия усыпляемых животных. Проверьте рН, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.
3. Приготовьте 500 мкл 180 ЕД/мл гепарина в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) на X . laevis или 200 мкл на X. tropicalis.
4. Проведите первичную эвтаназию, поместив Xenopus в этот раствор (из шага 1.2); Животное будет оставаться под водой в общей сложности 1 час.
5. Подтвердите, что Xenopus потерял свою болевую реакцию, ущипнув ногу через 15 минут после эвтаназии. Если животное реагирует, верните его в раствор для эвтаназии до тех пор, пока этот ответ не будет потерян.
6. Взвесьте Xenopus и проведите любые дополнительные измерения, необходимые перед отбором проб.
7. Используя иглу весом 31 г, введите X. laevis 250 мкл и X. tropicalis 100 мкл гепарина 180 ЕД/мл в PBS (с шага 1.3) в мускулатуру каждой передней конечности.
8. Готовят раствор 1 мл/г животного массой 54 ЕД/мл гепарина в перфузате PBS. Люди, более опытные с этим протоколом, могут обнаружить, что для полной перфузии требуется меньше среды.
9. Используйте иглу для подкожных инъекций 22 г для перфузии X. laevis и иглу для подкожных инъекций 25 г для X. tropicali s. Затупите перфузионную иглу, обрезав кончик кусачками (рис. 1)¹⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижает вероятность перфорации иглы через желудочек при смещении. В дополнение к притуплению, игла может быть слегка отшлифована точильным камнем или напильником, но все же остается достаточно острой, чтобы проткнуть желудочек.
10. Подготовьте насос, присоединив обрезанную иглу и циркулируя гепаринизированный перфузат PBS 54 ЕД/мл (из шага 1.8). Убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены из трубки, чтобы исключить возможность воздушной эмболии, которая приводит к снижению эффективности перфузии или отказу (см. Таблицу 1). Держите перфузионную среду на льду в течение всей процедуры.
11. Если насос не программируется, с установленной иглой измерьте объем перекачиваемой среды при различных настройках, чтобы определить, какие настройки наиболее близки к 5 мл/мин и 10 мл/мин. Эти скорости потока будут использоваться независимо от вида. Если перфузионный насос является программируемым, откалибруйте его с установленной иглой, следуя инструкциям производителя.
12. Поместите поверхность для вскрытия (лоток или лист пенопласта) под наклоном во вторичный контейнер или расположите ее так, чтобы облегчить дренаж крови.
13. После того, как лягушка находилась в растворе в течение 1 часа, первичная эвтаназия была завершена. Извлеките лягушку и еще раз проверьте потерю болевой реакции, выполнив ущипывание ногой.
14. Положите лягушку на спину и прижмите каждую конечность (рисунок 2). Если требуется сохранение тканей конечностей, тонкие штифты могут быть помещены через пальцы или U-образные скобы вокруг конечностей.
15. С помощью ножниц для рассечения прорежьте кожу, вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута. (Рисунок 2)
16. Используйте щипцы, чтобы захватить белую линию и вытащить ее из целомической полости (рис. 3). Аккуратно используйте ножницы, чтобы разрезать мускулатуру. Сделайте две створки из стенки полости и отрежьте или закрепите все створки в стороне.
17. Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать коракоидные кости и срезать лишнюю ткань, чтобы получить лучший доступ к сердцу (рис. 3).
18. Сердце все еще должно биться. Если сердце перестало биться до перфузии, обратите внимание, что свежесть образца была нарушена.

2. Перфузия

1. Определите желудок и аккуратно сдвиньте его так, чтобы он находился поверх левой доли печени (справа от зрителя), при этом его сосудистая сеть была видна на протяжении всей процедуры. Определите легкое и захватите его за кончик с помощью тканевых щипцов. Вытяните легкое за пределы целомической полости и проткните его через наконечник (рис. 4). Делайте это осторожно, так как лопнувшие кровеносные сосуды плохо перфузируются. Обратите внимание, видна ли кровь в доле, так как это повлияет на способность определить завершение процедуры.
2. Сделайте снимок целомической полости, чтобы лучше оценить эффективность перфузии и потенциально идентифицировать аномальные ткани на более позднем этапе.
3. Определите тонкий перикард и потяните его тканевыми щипцами (рисунок 5). Аккуратно перфорируйте перикард кончиком ножниц для иридэктомии, стараясь не порезать подлежащие ткани. Очистите перикард от трех камер сердца.
4. Используйте щипцы, чтобы осторожно захватить желудочек за его вершину. Приложите ограниченное давление, чтобы между тракционными поверхностями щипцов оставалось достаточно места для прохождения перфузионной иглы (рис. 6).
5. Введите иглу через закрытие щипцов в камеру желудочка, стараясь не перфорировать желудочек (рис. 7). Зажмите тканевые щипцы на месте с помощью иглодержателя с помощью гемостата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника стабилизирует положение иглы, которая все еще острая. Прижимание иглы непосредственно к желудочку также приведет к ненужным повреждениям, что затруднит рефиксацию в случае необходимости (см. Таблицу 1).
6. Запустите поток насоса примерно со скоростью 5 мл/мин. Три камеры сердца и артериального ствола набухают (рис. 8; см. таблицу 1).
7. Ножницами аккуратно проткните правую ушную раковину (слева от зрителя); Кровь прольется рекой. Установите скорость потока на уровне 5 мл/мин или увеличьте ее до 10 мл/мин.
8. Продолжайте до тех пор, пока сосудистая сеть желудка не побледнеет (см. Таблицу 1), затем копье левой ушной раковины сердца (справа от зрителя). Если скорость потока по-прежнему составляет 5 мл/мин, увеличьте ее примерно до 10 мл/мин.
9. Используйте трансферную пипетку для промывания целомической полости в перфузионных средах, чтобы помочь сохранить видимость и лучше оценить цвет перфузата, вытекающего из ушных раковин.
10. Удерживайте иглу на месте до тех пор, пока перфузат, вытекающий из ушных раковин, не станет прозрачным (см. Таблицу 1) и легкое не потеряет свой красный оттенок (см. Таблицу 1; Рисунок 9).

Результаты

После успешной перфузии все ткани (за исключением печени у пигментированного ксенопуса) будут заметно светлее и менее насыщены кровью. Крупные кровеносные сосуды станут менее заметными (рис. 10), а ткани (за исключением печени) будут чисто промыты в буфере после отбо?...

Обсуждение

Этот протокол описывает традиционные методы диссекции для доступа к целомической полости. Другие методы также приемлемы, при условии, что они наносят минимальный ущерб тканям, сердце доступно, а легкие и желудок видны. Точно так же большинство перечисленных инструментов вскрытия можн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP