تحسين عملية تربية الدبابير الخالية من الجراثيم

Summary

تم تشريح أجنة دبور ناسونيا من الشرانق Lucillia sericata بعد التطفل لمدة 12-24 ساعة وغسلها بالكحول ومحلول هيبوكلوريت الصوديوم 10٪ للحصول على أجنة خالية من الجراثيم. بعد تربية الأجنة الخالية من الجراثيم وتزويدها بوسط تربية Nasonia للنمو والتطور في المختبر ، تم الحصول على Nasonia البالغين الخالية من الجراثيم.

Abstract

تكنولوجيا التربية المعقمة هي طريقة لاستزراع الحشرات في ظل ظروف معقمة أو شبه معقمة ، والتي يمكن أن تقضي بشكل فعال على تأثير الكائنات الحية الدقيقة الخارجية على ميكروبات الحشرات وبالتالي تعزيز التطور السريع لأبحاث ميكروبات الحشرات. Nasonia (جنس الدبور) هي حشرة دبور طفيلية لها العديد من المزايا ، مثل العمر القصير ، والتباين الجيني العالي ، وسهولة التشغيل ، وما إلى ذلك ، وتستخدم على نطاق واسع كنظام نموذج للحشرات. على عكس العلاج بالمضادات الحيوية ، الذي يمكن أن يقلل فقط من عدد الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات ، يمكن لتقنيات التربية المعقمة التحكم في تكوين وكمية الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات ، مما يسهل دراسة تفاعلات المضيف والميكروب. ومع ذلك ، فإن الإصدارات السابقة من وسط تربية Nasonia (NRM) بها بعض العيوب والمشاكل ، مثل عملية التحضير المعقدة والمستهلكة للوقت ، والتلوث السهل بالبكتيريا أو الفطريات ، ووقت التخزين القصير. لذلك ، تحل هذه الدراسة هذه المشكلات من خلال تحسين الأدوات المستخدمة في عملية إعداد NRM وظروف التخزين ونسب المكونات. يمكن أن يسمح الوسط الأمثل بالتخزين عند -20 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل والقضاء على إمكانية تلوث NRM أثناء تغذية الدبابير المعقمة. هذا يحسن معدل البقاء على قيد الحياة والمستوى الصحي ل Nasonia المعقم ، وهو أمر مهم لاستخدام Nasonia كنموذج للبحوث الميكروبية.

Introduction

الحيوانات الخالية من الجراثيم هي لا تحتوي على كائنات حية حية وطفيليات يمكن اكتشافها¹. يمكن الحصول على أجنة خالية من الجراثيم عن طريق تشريح الأم في ظل ظروف معقمة ثم تربيتها لاحقا في أنظمة الحاجز². يمكن استخدام هذه الحيوانات لدراسة آثار الكائنات الحية الدقيقة على الحيوانات ، مثل الجراثيم المعوية ، والجهاز المناعي ، والتمثيل الغذائي¹. مع بعض الوسائل التقنية ، يمكن جعل العديد من الحشرات وحتى الثدييات معقمة ^3,4. تلعب الحيوانات الخالية من الجراثيم دورا فريدا وقد استخدمت على نطاق واسع في جوانب مختلفة من أبحاث علم الأحياء الدقيقة⁵. على سبيل المثال ، كشف استخدام دبابير Nasonia الخالية من الجراثيم أن الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تساعد المضيفين على التكيف مع البيئات الجديدة تحت الضغط البيئي الخارجي طويل الأجل ^6,7.

طفيليات Nasonia هي دبابير طفيلية صغيرة تحقن بيضها في شرانق الذباب⁴. هناك أربعة أنواع معروفة من ناسونيا ، بما في ذلك Nasonia vitripennis و Nasonia longicornis و Nasonia giraulti و Nasonia oneida⁸. يمكن العثور على N. vitripennis في جميع أنحاء العالم ، في حين أن الأنواع الثلاثة الأخرى لها نطاقات محدودة في أمريكا الشمالية⁴. تعتبر الدبابير الطفيلية Nasonia حشرات نموذجية مثالية بسبب خصائصها ، مثل سهولة الزراعة ، ودورة التكاثر القصيرة ، والجينوم المتسلسل ، و diapause طويل المدى ^8,9. يمكن استخدامها لدراسة جوانب مختلفة من تطور الحشرات ، وعلم الوراثة ، والتنمية ، والسلوك ، والتكافل¹⁰. علاوة على ذلك ، يمكن أن تساعد الدبابير الطفيلية Nasonia أيضا في السيطرة على الذباب الضار في الزراعة والأمراض¹¹. يتضمن الإنشاء الناجح لنظام الحشرات العقيمة خطوتين رئيسيتين: (1) تعقيم الأجنة و (2) توفير الغذاء المعقم لليرقات في المختبر. من أجل الحصول على طعام معقم ، طور Brucker and Bordenstein 12 وسط تربية Nasonia (NRMv1) في عام 2012 باستخدام مواد كيميائية مثل المضادات الحيوية والمبيض ومصل الجنين البقري لقتل البكتيريا¹². ومع ذلك ، أدت طريقة التعقيم الكيميائي إلى انخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة و eclosion من N. vitripennis¹³. ثم ، في عام 2016 ، شروبشاير وآخرون طور NRMv2 باستخدام طريقة تعقيم المرشح بدلا من طريقة التعقيم الكيميائي للقضاء على مخاطر المضادات الحيوية والمواد الأخرى ، وتحسين عملية التكاثر¹³. لسوء الحظ ، لا تزال هذه الطريقة لها بعض العيوب ، مثل التحديات المرتبطة بإعداد واستخدام الوسط ، فضلا عن مخاطر الغرق أو نقص التغذية أو الجفاف للأجنة واليرقات والشرانق المغلقة¹⁴. قام وانغ وبروكر¹⁴ مؤخرا بتحسين وسائط تربية ناسونيا الإصدار 3 (NRMv3) وبروتوكولات الإصدار 2 من التربية الخالية من الجراثيم (GFRv2). خفضت هذه التحسينات التكلفة واستهلاك الوسائط. ومع ذلك ، فإن NRMv3 لديه وقت تخزين قصير جدا وهو شديد التأثر بالتلوث.

بناء على NRMv3 ، تم تحسين طريقة تخزين أداة تحضير NRM ونسبة المغذيات في هذه الدراسة. يسهل هذا التحسين المنهجي استخدام N. vitripennis كنموذج لدراسات الميكروبيوم. بالمقارنة مع NRMv3 الذي طوره Wang et al.14 ، فإن الأداة المحسنة للضغط على Sarcophaga bullata pupa ، إحدى المواد الخام NRM ، تعزز بشكل كبير كفاءة إنتاج سائل الأنسجة S. bullata pupa مقارنة بحقنة 60 مل مع ثقب سفلي يستخدمه Wang et ^al.14. قمنا بتعديل نسبة المغذيات من NRM ، مما أدى إلى زيادة معينة في معدل بقاء دبابير Nasonia الخالية من الجراثيم دون التأثير على وقت نموها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعبئة NRM في أنابيب طرد مركزي ذات سعة صغيرة (1.5 مل) وتجميدها في ثلاجة -20 درجة مئوية لتمديد وقت التخزين. تجدر الإشارة إلى أنه بينما استخدمنا الذبابة المنزلية Lucilia sericata كمضيف ومصدر لإعداد NRM ، فمن المحتمل أن يتم تكييف هذا البروتوكول مع مضيفات Nasonia الأخرى المتوفرة في المختبر.

Protocol

1. تحضيروسط تربيةناسونيا الخالي من الجراثيم 

1. ضع الشرانق L. sericata المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) على سطح يمكن أن يستوعب جميع الشرانق ، مثل صينية أو ورقة. تخلص من أي يرقات متخلفة أو شرانق قديمة داكنة أو أصداف عذراء فارغة أو نشارة خشب أو شوائب أخرى. احتفظ فقط بالشرانق الصغيرة ذات اللون البني والأحمر وانقلها إلى دورق (حوالي 3000-4000 خادرة).
   ملاحظة: بعد إجراء العديد من التجارب ، وجد أن الوسط المصنوع من الشرانق القديمة المظلمة تحول بسهولة إلى اللون الداكن وأوقف تطور الدبابير الخالية من الجراثيم. لم تحدث هذه الظاهرة عند استخدام الشرانق الصغيرة ذات اللون البني والأحمر لإنتاج وسط. لا يزال سبب ذلك غير واضح ويتطلب مزيدا من التحقيق للتحقق منه.
2. أضف كمية كافية من الماء منزوع الأيونات إلى الكأس الزجاجية لتغطية سطح الشرانق بالكامل. لف فم الدورق بورق القصدير أو الشاش ، وهز الدورق لتنظيف الشوائب على سطح الشرانق ، ثم اسكب الماء. كرر ثلاث إلى خمس مرات.
3. ضع الشرانق L. sericata التي تم تنظيفها في خزان المرشح الخاص بمكبس الثوم ، واضغط بقوة ، واجمع سائل الأنسجة في الشرانق L. sericata في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل . ثم ، اسكب تفل الخادرة وضع الشرانق الجديدة في خزان المرشح في مكبس الثوم حتى يتم عصر الجميع.
   ملاحظة: بالمقارنة مع جهاز بثق الإبرة الذي يستخدمه Wang et ^al.14 ، فإن مكبس الثوم أكثر ملاءمة ويمكنه فصل السائل الخلالي بشكل أكثر شمولا. يضع هذا التقدم الأساس لإنتاج NRM على نطاق واسع وتخزينه على المدى الطويل.
4. يطرد الخليط على حرارة 4 درجات مئوية (25000 × جم) لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، سيتم فصل الخليط إلى ثلاث طبقات من الأسفل إلى الأعلى: طبقة الرواسب ، وطبقة البروتين ، وطبقة الدهون (الشكل 1).
5. لمنع الانسداد أثناء الترشيح ، قم بشفط طبقة البروتين باستخدام إبرة معقمة 18 جم ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم مخروطي جديد سعة 50 مل من مادة البولي بروبيلين.
6. أضف وسط ذبابة الفاكهة السائل التجاري (انظر جدول المواد) إلى مستخلص البروتين بنسبة 1: 1.
   ملاحظة: تم استخدام L. sericata التجارية الأكثر ملاءمة كمضيف ومواد خام NRM ، مقارنة ب NRMv3. لذلك ، تم تعديل النسبة الغذائية من 1: 2 إلى 1: 1 بناء على NRMv3 ، والتي كانت أكثر ملاءمة لنمو وتطور Nasonia المعقمة (الشكل 2).
7. قم بتصفية الوسط المختلط (وسط ذبابة الفاكهة ومستخلص البروتين من L. sericata pupa ) باستخدام نظام ترشيح فراغي بأحجام مسام مختلفة (8 و 1.2 و 0.8 و 0.45 ميكرومتر ؛ انظر جدول المواد) لإزالة الجسيمات ذات الأحجام المختلفة. لمنع الانسداد، قم بتغيير ورق الترشيح عندما يتباطأ التدفق.
   ملاحظة: يلزم استخدام أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 50 مل لكل ترشيح.
8. قم بطرد السائل مرة أخرى عند 4 درجات مئوية (15000 × جم) لمدة 10 دقائق وتعقيم الوسط الطافي من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. كرر الخطوات المذكورة أعلاه مرة واحدة.
9. قم بتخزين وسط الاستزراع عند -20 درجة مئوية بعد الاقتباس (الشكل 3 أ) للتخزين طويل الأجل.
   ملاحظة: لمنع التلوث والتجميد والذوبان المتكرر ، يوصى بفتح كل أنبوب من NRM مرة واحدة فقط عند استخدام وسط الاستزراع بعد التعبئة (الشكل 3 أ).

2. جمع البيض الخالي من الجراثيم

1. لضمان نسبة مستقرة من الذكور إلى الإناث في النسل ، ضع الشرانق في قارورة ذبابة الفاكهة خلال مرحلة العذراء بنسبة 50 أنثى إلى 15 ذكرا بسبب خصائصها الوراثية الأحادية الصيغة الصبغية (يتطور الذكور من خلايا أحادية الصيغة الصبغية ، بينما تتطور الإناث من خلايا ثنائية الصيغة الصبغية ناتجة عن البيض المخصب)^4,15.
   1. بعد الخروج للبالغين ، اسمح للذكور والإناث بالتزاوج لمدة 1.5 يوم ، ثم ضع حوالي 40 L. sericata pupae في القارورة. في غضون 12-24 ساعة بعد التطفل ، استخدم إبرة تشريح معقمة لفتح أحد طرفي قشرة العذراء بعناية تحت المجهر المجسم (الشكل 4).
   2. امسك الطرف الآخر باليد وابحث عن أجنة. استخدم إبرة تشريح لنقل الأجنة من سطح نسيج L. sericata pupa إلى مصفاة خلايا معقمة مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)¹⁴.
      ملاحظة: يجب استخدام الشرانق L. sericata القديمة للتطفل لأن أنسجة L. sericata pupa الجافة أسهل في نقل الأجنة . من أجل ضمان النقل السلس للبيض من سطح أنسجة L. sericata pupa ، حاول أن تكون حريصا على عدم ثقب الأنسجة عندما تفتح إبرة التشريح حالة العذراء حتى لا يتدفق السائل الخلالي.
2. ضع 20-30 جنينا على مصفاة خلوية واغسلها بالتساوي باستخدام 1000 ميكرولتر من محلول هيبوكلوريت الصوديوم التجاري بنسبة 10٪ (انظر جدول المواد) ، متبوعا بغسل آخر ب 1000 ميكرولتر من 1x PBS المعقم. بعد ذلك ، اغسل مرة واحدة باستخدام 1000 ميكرولتر من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ واغسله ثلاث مرات باستخدام 1000 ميكرولتر من 1x PBS المعقم.
3. أولا ، ضع ورقة شبكية من مادة البولي بروبيلين بقطر 5 مم (انظر جدول المواد) تم ترطيبها مسبقا باستخدام 1x PBS في لوحة 24 بئرا. ثم ، باستخدام فرشاة صغيرة معقمة ، قم بتنظيف أجنة برفق على مصفاة الخلية على ورقة شبكة البولي بروبلين. يمكن القيام بذلك لجميع الآبار الأربعة في عمود عمودي من لوحة 24 بئرا.

3. تربية الدبابير الخالية من الجراثيم

1. أضف 50 ميكرولتر من NRM إلى كل بئر في غطاء التدفق الصفحي. للحفاظ على بيئة رطبة للنمو ، أضف 1 مل من الماء المعقم بين كل بئر في لوحة 24 بئرا. يمكن أيضا وضع دورق صغير يحتوي على 30 مل من الماء المعقم في صندوق بلاستيكي معقم سعة 5 لتر مع لوحة 24 بئرا.
   1. طوال التجربة بأكملها ، احتفظ بالصندوق البلاستيكي المعقم واللوحة المكونة من 24 بئرا في غرفة المناخ عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 ± 2 درجة مئوية وتحت ضوء ثابت.
2. قبل نقل وإضافة NRM كل يوم ، قم بإذابة NRM المجمد على مقعد التدفق الرقائقي. في بيئة معقمة ، استخدم ملاقط مطهرة بالكحول لنقل شبكة البولي بروبلين مع اليرقات عليها من بئر إلى آخر. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من NRM التي تمت موازنتها لدرجة حرارة الغرفة (الشكل 3B). كرر العمليات المذكورة أعلاه كل يوم حتى يتم ملاحظة الشرانق.
   ملاحظة: مع تطور الدبابير ، يجب زيادة كمية NRM بشكل مناسب لضمان حصول الدبابير الخالية من الجراثيم على تغذية كافية. على سبيل المثال ، تم تزويد اليرقات الداخلية الرابعة ب 60 إلى 70 ميكرولتر من NRM. نظرا لأن مراحل النمو المختلفة قد تتعايش في نفس البئر ، استخدم فرشاة معقمة لنقل الشرانق. أضف كمية صغيرة من NRM إلى اليرقات المتبقية. استخدم تقنيات معقمة لتجنب غزو الميكروبات والتلوث.
3. بعد الرضاعة لمدة 9 إلى 11 يوما ، يتطور أكثر من 80٪ من اليرقات إلى خادرة بيضاء أو صفراء. في هذا الوقت ، انقل الفلتر إلى لوحة بئر نظيفة وتوقف عن إضافة وسيط استزراع لانتظار الإغلاق.

النتائج

تم تحسين كفاءة إعداد NRM بشكل كبير من خلال تحسين أدوات التحضير. بالإضافة إلى ذلك ، تم القضاء على مشكلة تلوث NRM في عملية التغذية من خلال تحسين الاستراتيجية وطريقة الحفظ. في الوقت نفسه ، كان لدى NRM المعدل نسبة غذائية أكثر ملاءمة لنمو وتطور الدبابير الخالية من الجراثيم مع L. sericata كمضيفين. تحس...

Discussion

مع تطبيق تقنيات الكشف عالية الإنتاجية مثل علم الجينوم والأيض ، أدرك الباحثون تدريجيا أن هناك تنوعا وراثيا هائلا وتعقيدا أيضيا في ميكروبيوتا الأمعاء¹⁶. ترتبط هذه البكتيريا التكافلية ارتباطا وثيقا بحالات فسيولوجية أو مرضية مختلفة ، مثل التمثيل الغذائي الغذائي للمضيف ، والأور?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56