Оптимизация процедуры выращивания безмикробных ос

Резюме

Эмбрионы осы Nasonia препарировали из куколок Lucillia sericata после паразитирования в течение 12-24 ч и промывали спиртом и 10% раствором гипохлорита натрия для получения безмикробных эмбрионов. После выращивания безмикробных эмбрионов и снабжения их средой для выращивания Nasonia для роста и развития in vitro были получены взрослые особи Nasonia без микробов.

Аннотация

Технология асептического выращивания – это метод культивирования насекомых в стерильных или почти стерильных условиях, который позволяет эффективно исключить влияние внешних микроорганизмов на микробиоту насекомых и тем самым способствовать быстрому развитию исследований микробиоты насекомых. Nasonia (род ос) - это паразитическое насекомое-оса, которое имеет много преимуществ, таких как короткая продолжительность жизни, высокая генетическая изменчивость, простота в эксплуатации и т. д., и широко используется в качестве модельной системы насекомых. В отличие от лечения антибиотиками, которое может только уменьшить количество микроорганизмов у животных, методы асептического выращивания могут контролировать как состав, так и количество микроорганизмов у животных, что еще больше облегчает изучение взаимодействий хозяина и микроба. Однако предыдущие версии среды для выращивания Nasonia (NRM) имеют некоторые дефекты и проблемы, такие как сложный и трудоемкий процесс приготовления, легкое загрязнение бактериями или грибками и короткое время хранения. Таким образом, данное исследование решает эти проблемы за счет оптимизации инструментов, используемых в процессе подготовки NRM, условий хранения и соотношения компонентов. Оптимизированная среда может обеспечить хранение при -20 °C в течение не менее 3 месяцев и исключить возможность загрязнения NRM во время кормления стерильных ос. Это еще больше улучшает выживаемость и уровень здоровья асептической Nasonia, что важно для использования Nasonia в качестве модели для микробных исследований.

Введение

Безмикробные животные - это животные, у которых нет обнаруживаемых живых микроорганизмов и паразитов¹. Эмбрионы, не содержащие зародышей, могут быть получены путем вскрытия матери в асептических условиях и впоследствии выращены в барьерных системах². Такие животные могут быть использованы для изучения воздействия микроорганизмов на животных, таких как кишечная микробиота, иммунная система и метаболизм¹. С помощью определенных технических средств многие насекомые и даже млекопитающие могут быть стерильны ^3,4. Безмикробные животные играют уникальную роль и широко используются в различных аспектах микробиологических исследований⁵. Например, использование безмикробных ос Nasonia показало, что микроорганизмы могут помочь хозяевам адаптироваться к новым условиям в условиях длительного экзогенного стресса^{окружающей среды 6,7}.

Паразитоиды Nasonia - это мелкие паразитические осы, которые впрыскивают свои яйца в куколок мух⁴. Известно четыре вида Nasonia, в том числе Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti и Nasonia oneida⁸. N. vitripennis можно найти по всему миру, в то время как три других вида имеют ограниченный ареал в Северной Америке⁴. Паразитоидные осы Nasonia считаются идеальными модельными насекомыми из-за их характеристик, таких как простота выращивания, короткий цикл размножения, секвенированный геном и длительная диапауза ^8,9. Их можно использовать для изучения различных аспектов эволюции насекомых, генетики, развития, поведения и симбиоза¹⁰. Кроме того, паразитоидные осы Nasonia также могут помочь в борьбе с вредными мухами в сельском хозяйстве и болезнями¹¹. Успешное создание стерильной системы насекомых включает в себя два основных этапа: (1) стерилизацию эмбрионов и (2) предоставление стерильной пищи личинкам in vitro. Чтобы получить стерильную пищу, Брукер и Борденштейн 12 разработали среду для выращивания Nasonia (NRMv1) в 2012 году с использованием химических веществ, таких как антибиотики, отбеливатель и эмбриональная бычья сыворотка, для уничтожения бактерий¹². Однако метод химической стерилизации привел к низкой выживаемости и скорости экклозии N. vitripennis¹³. Затем, в 2016 году, Shropshire et al. разработали NRMv2 с использованием метода стерилизации фильтра вместо метода химической стерилизации для устранения опасности антибиотиков и других веществ и оптимизировали процесс размножения¹³. К сожалению, этот метод все еще имеет некоторые недостатки, такие как проблемы, связанные с подготовкой и использованием среды, а также риски утопления, недокармливания или обезвоживания эмбрионов, личинок и закрытых куколок¹⁴. Wang and Brucker¹⁴ недавно улучшили протоколы выращивания Nasonia версии 3 (NRMv3) и безмикробного выращивания версии 2 (GFRv2). Эти улучшения снизили стоимость и потребление мультимедиа. Однако NRMv3 имеет очень короткое время хранения и очень подвержен загрязнению.

Основываясь на NRMv3, в этом исследовании были оптимизированы метод хранения инструмента для подготовки NRM и соотношение питательных веществ. Это методологическое уточнение облегчает использование N. vitripennis в качестве модели для исследований микробиома. По сравнению с NRMv3, разработанным Wang et al.14, улучшенный инструмент для выдавливания куколки Sarcophaga bullata, одного из сырьевых материалов NRM, значительно повышает эффективность производства тканевой жидкости куколки S. bullata по сравнению со шприцем объемом 60 мл с нижним отверстием, используемым Wang et al.14. Мы скорректировали соотношение питательных веществ NRM, что привело к определенному увеличению выживаемости безмикробных ос Nasonia, не влияя на время их развития. Кроме того, NRM упаковывали в центрифужные пробирки малой емкости (1,5 мл) и замораживали в холодильнике с температурой -20 °C, чтобы продлить срок хранения. Стоит отметить, что, хотя мы использовали комнатную муху Lucilia sericata в качестве хозяина и источника для получения NRM, этот протокол, вероятно, может быть адаптирован для других хозяев Nasonia, которые доступны в лаборатории.

протокол

1. Приготовление безмикробнойсреды для выращиваниянасонии 

1. Поместите имеющихся в продаже куколок L. sericata (см. Таблицу материалов) на поверхность, на которой могут разместиться все куколки, например, на лоток или лист бумаги. Выбросьте все недоразвитые личинки, темные старые куколки, пустые оболочки куколок, опилки или другие примеси. Оставляйте только молодых куколок коричневато-красного цвета и переносите их в стакан (примерно 3000-4000 куколок).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После проведения многих экспериментов было обнаружено, что среда, сделанная из темных старых куколок, легко темнела и останавливала развитие безмикробных ос. Это явление не возникало при использовании молодых коричневато-красных куколок для получения среды. Причина этого до сих пор неясна и требует дальнейшего расследования для ее проверки.
2. Добавьте в стакан достаточное количество деионизированной воды, чтобы покрыть всю поверхность куколок. Оберните горлышко стакана фольгой или марлей, встряхните стакан, чтобы очистить поверхность куколок от загрязнений, а затем вылейте воду. Повторите три-пять раз.
3. Поместите очищенные куколки L. sericata в фильтрующий резервуар чесночного пресса, сильно отожмите и соберите тканевую жидкость куколок L. sericata в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл . Затем вылейте куколку и поместите новые куколки в фильтрующий резервуар чесночного пресса, пока все не сожмется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с игольчатым экструзионным устройством, используемым Wang et ^al.14, чесночный пресс более удобен и может более тщательно отделять интерстициальную жидкость. Это усовершенствование закладывает основу для крупномасштабного производства и длительного хранения NRM.
4. Центрифугируйте смесь при 4 °C (25 000 x g) в течение 10 мин. После центрифугирования смесь будет разделена на три слоя снизу вверх: слой осадка, белковый слой и жировой слой (рис. 1).
5. Чтобы предотвратить засорение во время фильтрации, аспирируйте белковый слой с помощью стерильной иглы 18 г и перенесите его в новую коническую стерильную полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
6. Добавьте коммерческую жидкую среду дрозофилы (см. Таблицу материалов) в белковый экстракт в соотношении 1:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более удобный коммерциализированный L. sericata использовался в качестве сырья-хозяина и NRM по сравнению с NRMv3. Таким образом, соотношение питательных веществ было скорректировано с 1:2 до 1:1 на основе NRMv3, который больше подходил для роста и развития стерильных Nasonia (рис. 2).
7. Фильтруют смешанную среду (среду дрозофилы и белковый экстракт куколки L. sericata ) с помощью вакуумной системы фильтрации с различными размерами пор (8, 1,2, 0,8 и 0,45 мкм; см. Таблицу материалов) для удаления частиц разного размера. Чтобы предотвратить засорение, меняйте фильтровальную бумагу при замедлении потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой фильтрации требуется использование новой стерильной центрифужной пробирки объемом 50 мл.
8. Снова центрифугируйте жидкость при 4 °C (15 000 x g) в течение 10 мин и стерилизуйте надосадочную среду через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Повторите описанные выше шаги один раз.
9. Хранят питательную среду при -20 °C после аликвотирования (рис. 3А) для длительного хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения загрязнения и повторного замораживания и оттаивания рекомендуется открывать каждую пробирку NRM только один раз при использовании питательной среды после упаковки (рис. 3A).

2. Сбор яиц без микробов

1. Чтобы обеспечить стабильное соотношение самцов и самок у потомства, поместите куколок во флакон дрозофилы на стадии куколки в соотношении 50 самок к 15 самцам из-за их гаплоидных генетических характеристик (самцы развиваются из гаплоидных клеток, а самки развиваются из диплоидных клеток, которые образуются в результате оплодотворенных яйцеклеток)^4,15.
   1. После выхода во взрослую особь дайте самцам и самкам спариваться в течение 1,5 дней, а затем положите во флакон около 40 л куколок серикаты . В течение 12-24 ч после паразитирования стерильной рассекающей иглой осторожно вскрывают один конец оболочки куколки под стереомикроскопом (рис. 4).
   2. Возьмитесь за другой конец рукой и найдите зародыши осы. Используйте рассекающую иглу для переноса эмбрионов с поверхности ткани куколки L. sericata в стерильное клеточное ситечко с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS)¹⁴.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более старые куколки L . sericata следует использовать для паразитирования, потому что сухая ткань куколки L. sericata легче переносит эмбрионы. Чтобы обеспечить плавный перенос яиц с поверхности ткани куколки L. sericata , старайтесь быть осторожными, чтобы не проколоть ткань, когда рассекающая игла открывает корпус куколки, чтобы интерстициальная жидкость не вытекла.
2. Поместите 20-30 эмбрионов на клеточный фильтр и равномерно промойте их 1000 мкл 10% коммерческого раствора гипохлорита натрия (см. Таблицу материалов), а затем еще раз промывка 1000 мкл 1x стерильного PBS. Затем один раз промойте 1,000 мкл 70% раствора этанола и трижды промойте 1,000 мкл 1x стерильного PBS.
3. Во-первых, поместите лист полипропиленовой сетки диаметром 5 мм (см. Таблицу материалов), предварительно смачиваемый 1x PBS, в пластину с 24 лунками. Затем, используя стерилизованную маленькую щетку, аккуратно смахните зародыши ос с клеточного ситечка на лист полипропиленовой сетки. Это может быть сделано для всех четырех скважин в вертикальной колонне 24-луночной плиты.

3. Безмикробное выращивание ос

1. Добавьте 50 мкл NRM в каждую лунку в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Чтобы поддерживать влажную среду для роста, добавьте 1 мл стерильной воды между каждой лункой в 24-луночную пластину. Небольшой стакан, содержащий 30 мл стерильной воды, также может быть помещен в стерильную пластиковую коробку объемом 5 л с 24-луночной пластиной.
   1. На протяжении всего эксперимента храните стерильный пластиковый ящик и 24-луночную пластину в климатической камере при постоянной температуре 25 ± 2 °C и при постоянном освещении.
2. Перед переносом и добавлением NRM каждый день размораживайте замороженный NRM на скамье с ламинарным потоком. В стерильной среде используйте продезинфицированный спиртом пинцет для переноса полипропиленовой сетки с находящимися на ней личинками из одной лунки в другую. Наконец, добавьте 50 мкл NRM, который был уравновешен до комнатной температуры (рис. 3B). Повторяйте вышеуказанные операции каждый день до тех пор, пока не будут замечены куколки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С развитием ос количество NRM должно быть соответствующим образом увеличено, чтобы обеспечить достаточное питание ос, свободных от микробов. Например, личинки четвертого возраста получали от 60 до 70 мкл NRM. Поскольку разные стадии развития могут сосуществовать в одной и той же лунке, используйте стерилизованную щетку для переноса куколок. Добавьте небольшое количество NRM к оставшимся личинкам. Используйте асептические методы, чтобы избежать микробной инвазии и загрязнения.
3. После кормления в течение 9-11 дней более 80% личинок развиваются в белые или желтые куколки. В это время переместите фильтр в чистую лунку и прекратите добавлять питательную среду, чтобы дождаться экзоза.

Результаты

Эффективность подготовки NRM была значительно улучшена за счет совершенствования инструментов подготовки. Кроме того, проблема загрязнения NRM в процессе кормления была устранена за счет оптимизации стратегии и метода сохранения. В то же время скорректированный NRM имел более подходящее...

Обсуждение

С применением высокопроизводительных технологий обнаружения, таких как геномика и метаболомика, исследователи постепенно осознали, что в микробиоте кишечника существует огромное генетическое разнообразие и сложность метаболизма¹⁶. Эти симбиотические бактерии тесно свя...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56