אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות נטולות חיידקים

Summary

עוברי צרעת נסוניה נותחו מגלמי Lucillia sericata לאחר טפילים במשך 12-24 שעות ונשטפו בתמיסת אלכוהול ונתרן היפוכלוריט 10% כדי להשיג עוברים נטולי חיידקים. לאחר גידול העוברים נטולי הנבט ואספקת מצע גידול נסוניה, כדי לגדול ולהתפתח במבחנה, התקבלו בוגרים נטולי חיידקים של נסוניה.

Abstract

טכנולוגיית גידול אספטי היא שיטה לגידול חרקים בתנאים סטריליים או כמעט סטריליים, אשר יכולה לחסל ביעילות את ההשפעה של מיקרואורגניזמים חיצוניים על מיקרוביוטה של חרקים ובכך לקדם את ההתפתחות המהירה של מחקר מיקרוביוטה חרקים. נסוניה (סוג צרעה) הוא חרק צרעה טפילי בעל יתרונות רבים, כגון תוחלת חיים קצרה, שונות גנטית גבוהה, תפעול קל ועוד, ונמצא בשימוש נרחב כמערכת מודל חרקים. שלא כמו טיפול אנטיביוטי, אשר יכול רק להפחית את מספר המיקרואורגניזמים בבעלי חיים, טכניקות גידול אספטיות יכולות לשלוט הן על הרכב וכמות מיקרואורגניזמים בבעלי חיים, מה שמקל עוד יותר על המחקר של אינטראקציות מיקרואורגניזם מארח. עם זאת, גרסאות קודמות של מדיום גידול Nasonia (NRM) יש כמה פגמים ובעיות, כגון תהליך הכנה מורכב וגוזל זמן, זיהום קל על ידי חיידקים או פטריות, וזמן אחסון קצר. לכן, מחקר זה פותר בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של הכלים המשמשים בתהליך הכנת NRM, תנאי אחסון ויחסי רכיבים. התווך הממוטב יכול לאפשר אחסון בטמפרטורה של -20°C למשך 3 חודשים לפחות ולמנוע את האפשרות של זיהום NRM במהלך האכלת צרעות סטריליות. זה משפר עוד יותר את שיעור ההישרדות ואת רמת הבריאות של Nasonia אספטית, אשר חשוב לשימוש Nasonia כמודל למחקר מיקרוביאלי.

Introduction

בעלי חיים נטולי חיידקים הם בעלי חיים שאין להם מיקרואורגניזמים חיים וטפילים הניתנים לזיהוי¹. ניתן להשיג עוברים נטולי חיידקים על ידי ניתוח האם בתנאים אספטיים ולאחר מכן לגדלם במערכות מחסום². בעלי חיים כאלה יכולים לשמש לחקר ההשפעות של מיקרואורגניזמים על בעלי חיים, כגון על המיקרוביוטה של המעי, מערכת החיסון וחילוף החומרים¹. באמצעים טכניים מסוימים, חרקים רבים ואפילו יונקים יכולים להפוך לסטריליים ^3,4. לבעלי חיים נטולי חיידקים יש תפקיד ייחודי והם נמצאים בשימוש נרחב בהיבטים שונים של מחקר מיקרוביולוגי⁵. לדוגמה, השימוש בצרעות Nasonia נטולות חיידקים גילה כי מיקרואורגניזמים יכולים לעזור למארחים להסתגל לסביבות חדשות תחת לחץ סביבתי אקסוגני ארוך טווח ^6,7.

טפילי נסוניה הם צרעות טפיליות קטנות המזריקות את ביציהן לגלמים של זבובים⁴. ישנם ארבעה מינים ידועים של נסוניה, כולל Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti ו- Nasonia oneida⁸. ניתן למצוא N. vitripennis ברחבי העולם, בעוד שלשלושת המינים האחרים יש טווח מוגבל בצפון אמריקה⁴. צרעות טפיליות נסוניה נחשבות לחרקים מודל אידיאליים בגלל המאפיינים שלהן, כגון גידול קל, מחזור רבייה קצר, רצף גנום ודיאפאוזה ^8,9 לטווח ארוך. ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של אבולוציה של חרקים, גנטיקה, התפתחות, התנהגות וסימביוזה¹⁰. יתר על כן, צרעות טפיליות נסוניה יכולות גם לסייע בהדברת זבובים מזיקים בחקלאות ובמחלות¹¹. הקמתה המוצלחת של מערכת חרקים סטרילית כרוכה בשני שלבים עיקריים: (1) עיקור העוברים ו-(2) אספקת מזון סטרילי לזחלים במבחנה. על מנת להשיג מזון סטרילי, ברוקר ובורדנשטיין 12 פיתחו מדיום גידול נסוניה (NRMv1) בשנת 2012 על ידי שימוש בכימיקלים כגון אנטיביוטיקה, אקונומיקה וסרום בקר עוברי כדי להרוג חיידקים¹². עם זאת, שיטת העיקור הכימי הביאה לשיעורי הישרדות ואקלוסיה נמוכים של N. vitripennis¹³. לאחר מכן, בשנת 2016, Shropshire et al. פיתחו את NRMv2 באמצעות שיטת עיקור מסנן במקום שיטת עיקור כימי כדי לחסל את הסיכונים של אנטיביוטיקה וחומרים אחרים, וייעלו את תהליך הרבייה¹³. למרבה הצער, לשיטה זו יש עדיין כמה חסרונות, כגון האתגרים הקשורים להכנת המדיום והשימוש בו, כמו גם הסיכונים לטביעה, תת-האכלה או התייבשות עבור העוברים, הזחלים והגלמים הסגורים¹⁴. וואנג וברוקר¹⁴ שיפרו לאחרונה את גרסת המדיה לגידול Nasonia גרסה 3 (NRMv3) ואת פרוטוקולי הגרסה 2 (GFRv2) לגידול ללא חיידקים. שיפורים אלה הפחיתו את העלות ואת צריכת המדיה. עם זאת, ל-NRMv3 יש זמן אחסון קצר מאוד והוא רגיש מאוד לזיהום.

בהתבסס על NRMv3, שיטת אחסון כלי ההכנה של NRM ויחס החומרים המזינים עברו אופטימיזציה במחקר זה. עידון מתודולוגי זה מאפשר שימוש ב-N. vitripennis כמודל למחקרי מיקרוביום. בהשוואה ל- NRMv3 שפותח על ידי וואנג ואחרים 14, הכלי המשופר לסחיטת סרקופגה בולטה גולם, אחד מחומרי הגלם של NRM, משפר מאוד את יעילות הייצור של נוזל רקמת S. bullata pupa בהשוואה למזרק 60 מ"ל עם חור תחתון המשמש את וואנג ואחרים ¹⁴. התאמנו את יחס החומרים המזינים של NRM, מה שהוביל לעלייה מסוימת בשיעור ההישרדות של צרעות נסוניה נטולות חיידקים מבלי להשפיע על זמן ההתפתחות שלהן. בנוסף, ה-NRM נארז בצינורות צנטריפוגות בעלי קיבולת קטנה (1.5 מ"ל) והוקפא במקרר בטמפרטורה של -20°C כדי להאריך את זמן האחסון. ראוי לציין כי בעוד שהשתמשנו בזבוב הבית Lucilia sericata כמארח וכמקור להכנת NRM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ככל הנראה למארחי Nasonia אחרים הזמינים במעבדה.

Protocol

1. הכנתמדיום גידולנסוניה ללא חיידקים 

1. הניחו את הגלמים L. sericata הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים) על משטח שיכול להכיל את כל הגלמים כגון מגש או גיליון נייר. השליכו זחלים לא מפותחים, גלמים ישנים כהים, קליפות גולם ריקות, נסורת או זיהומים אחרים. החזיקו רק גלמים צעירים שצבעם חום-אדום והעבירו אותם לכד (כ-3,000-4,000 גלמים).
   הערה: לאחר ביצוע ניסויים רבים, נמצא כי התווך העשוי מהגלמים הישנים והכהים הפך בקלות לכהה ועצר את התפתחותן של צרעות נטולות חיידקים. תופעה זו לא התרחשה כאשר השתמשו בגלמים החומים-אדומים הצעירים לייצור מדיום. הסיבה לכך עדיין אינה ברורה ודורשת חקירה נוספת כדי לאמת אותה.
2. הוסיפו מספיק מים נטולי יונים, כדי לכסות את כל פני השטח של הגלמים. לעטוף את הפה של הכד עם tinfoil או גזה, לנער את הכד כדי לנקות את הזיהומים על פני השטח של הגלמים, ולאחר מכן לשפוך את המים. חזור על הפעולה שלוש עד חמש פעמים.
3. הניחו את הגלמים הנקיים של L. sericata במיכל הסינון של מכבש שום, סחטו חזק ואספו את נוזל הרקמה של הגלמים L. sericata בצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל. לאחר מכן, יוצקים את שאריות הגלמים ומכניסים גלמים חדשים למיכל הסינון של מכבש השום עד שכולם נסחטים.
   הערה: בהשוואה למכשיר שחול המחט המשמש את וואנג ואחרים ¹⁴, מכבש השום נוח יותר ויכול להפריד את נוזל האינטרסטיציאל בצורה יסודית יותר. התקדמות זו מניחה את היסודות לייצור בקנה מידה גדול ואחסון לטווח ארוך של NRM.
4. צנטריפוגה את התערובת בטמפרטורה של 4°C (25,000 x גרם) למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, התערובת תופרד לשלוש שכבות מלמטה למעלה: שכבת משקעים, שכבת חלבון ושכבת שומן (איור 1).
5. כדי למנוע סתימה במהלך הסינון, שאפו את שכבת החלבון באמצעות מחט סטרילית 18 גרם והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה סטרילי חרוטי חדש של 50 מ"ל.
6. הוסיפו מדיום דרוזופילה נוזלי מסחרי (ראו טבלת חומרים) לתמצית החלבון ביחס של 1:1.
   הערה: L. sericata ממוסחר נוח יותר שימש כחומר גלם מארח ו-NRM, בהשוואה ל-NRMv3. לכן, היחס התזונתי הותאם מ-1:2 ל-1:1 בהתבסס על NRMv3, שהיה מתאים יותר לגדילה ולהתפתחות של נסוניה סטרילית (איור 2).
7. סנן את התווך המעורב (מדיום דרוזופילה ותמצית חלבון של L. sericata pupa) באמצעות מערכת סינון ואקום עם גדלי נקבוביות שונים (8, 1.2, 0.8 ו- 0.45 מיקרומטר; ראה טבלת חומרים) כדי להסיר חלקיקים בגדלים שונים. כדי למנוע סתימה, החלף את נייר הסינון כאשר הזרימה מאטה.
   הערה: השימוש בצינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל נדרש עבור כל סינון.
8. צנטריפוגו את הנוזל שוב בטמפרטורה של 4°C (15,000 x g) למשך 10 דקות ועיקרו את התווך הסופרנאטנטי דרך מסנן מזרקים של 0.22 מיקרומטר. חזור על השלבים לעיל פעם אחת.
9. אחסנו את מדיום התרבית בטמפרטורה של -20°C לאחר הציטוט (איור 3A) לאחסון לטווח ארוך.
   הערה: כדי למנוע זיהום והקפאה והפשרה חוזרות ונשנות, מומלץ לפתוח כל צינורית של NRM פעם אחת בלבד בעת שימוש במדיום התרבית לאחר האריזה (איור 3A).

2. איסוף ביצים ללא חיידקים

1. כדי להבטיח יחס יציב בין זכר לנקבה בצאצאים, הניחו את הגלמים בבקבוקון דרוזופילה בשלב הגלמים ביחס של 50 נקבות ל-15 זכרים בגלל המאפיינים הגנטיים ההפלואידים שלהם (זכרים מתפתחים מתאים הפלואידים, בעוד שהנקבות מתפתחות מתאים דיפלואידיים הנובעים מביציות מופרות)^4,15.
   1. לאחר הגיחה לבוגרים, אפשרו לזכרים ולנקבות להזדווג במשך יום וחצי, ולאחר מכן הכניסו כ -40 גלמים L. sericata לתוך הבקבוקון. בתוך 12-24 שעות לאחר הטפילות, השתמשו במחט ניתוח סטרילית כדי לפתוח בזהירות קצה אחד של קליפת הגולם תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 4).
   2. החזיקו את הקצה השני ביד ומצאו את עוברי הצרעה. השתמש במחט ניתוח כדי להעביר עוברים מפני השטח של רקמת הגלמים L. sericata למסננת תאים סטרילית עם מלח חוצץ פוספט (PBS)¹⁴.
      הערה: יש להשתמש בגלמים ישנים יותר של L. sericata לטיפול בטפילות, מכיוון שרקמת L. sericata pupa היבשה קלה יותר להעברת עוברים. על מנת להבטיח העברה חלקה של ביצים משטח רקמת הגלמים L. sericata, נסו להיזהר שלא לנקב את הרקמה כאשר המחט המנותחת פותחת את מארז הגולם, כך שהנוזל הבין-תאי לא יזרום החוצה.
2. הניחו 20-30 עוברים על מסננת תאים ושטפו אותם באופן שווה עם 1,000 μL של 10% תמיסת נתרן היפוכלוריט מסחרית (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן שטיפה נוספת עם 1,000 μL של PBS סטרילי אחד. לאחר מכן, יש לשטוף פעם אחת עם 1,000 μL של תמיסת אתנול 70% ולשטוף שלוש פעמים עם 1,000 μL של PBS סטרילי אחד.
3. ראשית, הניחו יריעת רשת פוליפרופילן בקוטר 5 מ"מ (ראו טבלת חומרים) שהורטבה מראש עם PBS 1x לתוך צלחת בעלת 24 בארות. לאחר מכן, באמצעות מברשת קטנה מעוקרת, הברישו בעדינות את עוברי הצרעה על מסננת התאים על יריעת רשת הפוליפרופילן. ניתן לעשות זאת עבור כל ארבע הבארות בטור אנכי של צלחת 24 בארות.

3. גידול צרעות ללא חיידקים

1. הוסף 50 μL של NRM לכל באר במכסה מנוע זרימה למינרית. כדי לשמור על סביבה לחה לצמיחה, הוסף 1 מ"ל מים סטריליים בין כל באר בצלחת 24 בארות. קטנה המכילה 30 מ"ל מים סטריליים יכולה להיות ממוקמת גם בקופסת הפלסטיק הסטרילית 5 L עם צלחת 24 בארות.
   1. לאורך כל הניסוי, שמרו את קופסת הפלסטיק הסטרילית ואת צלחת 24 הבארות בתא אקלים בטמפרטורה קבועה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ותחת אור קבוע.
2. לפני העברה והוספה של NRM מדי יום, הפשירו את ה-NRM הקפוא על ספסל זרימה למינרי. בסביבה סטרילית, השתמש בפינצטה מחוטאת אלכוהול כדי להעביר את רשת הפוליפרופילן עם הזחלים עליה מבאר אחת לאחרת. לבסוף, הוסיפו 50 מיקרוליטר של NRM ששוקל לטמפרטורת החדר (איור 3B). חזור על הפעולות הנ"ל כל יום עד שגלמים נצפים.
   הערה: עם התפתחות הצרעות, יש להגדיל את כמות ה-NRM כראוי כדי להבטיח שלצרעות נטולות חיידקים יש תזונה מספקת. לדוגמה, הזחלים הכוכבים הרביעי סופקו עם 60 עד 70 μL של NRM. מכיוון ששלבי התפתחות שונים עשויים להתקיים יחד באותה באר, השתמשו במברשת מעוקרת כדי להעביר את הגלמים החוצה. הוסיפו כמות קטנה של NRM לזחלים הנותרים. השתמש בטכניקות אספטיות כדי למנוע פלישה מיקרוביאלית וזיהום.
3. לאחר האכלה במשך 9 עד 11 ימים, יותר מ -80% מהזחלים מתפתחים לגלמים לבנים או צהובים. בשלב זה, העבירו את הפילטר לצלחת באר נקייה והפסיקו להוסיף מדיום תרבית כדי להמתין לאקלוזיה.

תוצאות

יעילות ההכנה של NRM שופרה מאוד על ידי שיפור כלי ההכנה. בנוסף, בעיית זיהום NRM בתהליך ההזנה בוטלה על ידי אופטימיזציה של האסטרטגיה ושיטת השימור. יחד עם זאת, ל-NRM המותאם היה יחס תזונתי מתאים יותר לגדילה והתפתחות של צרעות נטולות חיידקים עם L. sericata כפונדקאים. שיעור ההישרדות של צרעות נטולות חיידק...

Discussion

עם היישום של טכנולוגיות זיהוי תפוקה גבוהה כגון גנומיקה ומטבולומיקה, חוקרים הבינו בהדרגה שיש מגוון גנטי עצום ומורכבות מטבולית במיקרוביוטה של המעי¹⁶. חיידקים סימביוטיים אלה קשורים קשר הדוק למצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים, כגון מטבוליזם תזונתי של המאכסן, גידולים, חסינות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56