优化无菌黄蜂的饲养程序

Summary

从蛹中解剖Nasonia蜂胚胎，寄生12-24 h后，用酒精和10%次氯酸钠溶液洗涤，得到无菌胚胎。在培育无菌胚胎并为其提供Nasonia饲养培养基进行体外生长和发育后，获得了无菌Nasonia成虫。

Abstract

无菌饲养技术是一种在不育或几乎无菌的条件下培养昆虫的方法，可以有效消除外界微生物对昆虫菌群的影响，从而促进昆虫菌群研究的快速发展。Nasonia（黄蜂属）是一种寄生蜂昆虫，具有寿命短、遗传变异高、操作方便等优点，被广泛用作昆虫模型系统。与只能减少动物体内微生物数量的抗生素处理不同，无菌饲养技术可以控制动物体内微生物的组成和数量，进一步促进宿主-微生物相互作用的研究。然而，以前版本的Nasonia饲养培养基（NRM）存在一些缺陷和问题，例如制备过程复杂且耗时，容易被细菌或真菌污染以及储存时间短。因此，本研究通过优化NRM制备过程中使用的工具，储存条件和组分比例来解决这些问题。优化后的培养基可以在-20°C下储存至少3个月，并消除在喂食无菌黄蜂时NRM污染的可能性。这进一步提高了无菌Nasonia的存活率和健康水平，这对于使用Nasonia作为微生物研究的模型非常重要。

Introduction

无菌动物是指没有可检测到的活微生物和寄生虫的动物¹.无菌胚胎可以通过在无菌条件下解剖母体来获得，随后在屏障系统中饲养²。这类动物可用于研究微生物对动物的影响，如对肠道微生物群、免疫系统和代谢^{的影响1。}通过一定的技术手段，许多昆虫甚至哺乳动物都可以不育3^，4。无菌动物具有独特的作用，并已广泛应用于微生物学研究的各个方面⁵.例如，使用无菌Nasonia黄蜂已经揭示了微生物可以帮助宿主在长期外源环境胁迫下适应新环境^6，7。

Nasonia寄生蜂是小型寄生蜂，将卵^注入苍蝇的蛹中4。Nasonia有四种已知的物种，包括Nasonia vitripennis，Nasonia longicornis，Nasonia giraulti和Nasonia oneida

Protocol

1.无菌纳索尼亚饲养培养基的制备 

1. 将市售的 绢毛蛹 （见 材料表）放在可以容纳所有蛹的表面上，例如托盘或一张纸。丢弃任何发育不全的幼虫、深色老蛹、空蛹壳、锯末或其他杂质。只保留棕红色的幼蛹，并将其转移到烧杯中（约3，000-4，000个蛹）。
   注意：经过多次实验，发现由深色老蛹制成的培养基很容易变黑，并阻止了无菌黄蜂的发育。当使用幼棕红色蛹产生培养基时，不会发生这种现象。其原因尚不清楚，需要进一步调查以核实。
2. 向烧杯中加入足够的去离子水以覆盖蛹的整个表面。用锡纸或纱布包裹烧杯口，摇晃烧杯清洁蛹表面的杂质，然后倒出水。重复三到五次。
3. 将清洁的 绢毛蛹 放入大蒜压榨机的过滤罐中，用力挤压，并将 绢毛蛹 的组织液收集在 50 mL 无菌离心管中。然后，倒出蛹渣，将新蛹放入压蒜机的过滤罐中，直到全部被挤压。
   注意：与Wang等人¹⁴使用的针状挤压装置相比，大蒜压榨机更方便，可以更彻底地分离组织液。这一进步为NRM的大规模生产和长期储存奠定了基础。
4. 将混合物在4°C（25，000× g）下离心10分钟。离心后，混合物将从下到上分成三层：沉淀层、蛋白质层和脂肪层（图 1

Discussion

随着基因组学、代谢组学等高通量检测技术的应用，研究人员逐渐意识到肠道微生物群中存在巨大的遗传多样性和代谢复杂性¹⁶。这些共生细菌通过与宿主的复杂相互作用，与宿主营养代谢、肿瘤、免疫力、衰老等各种生理或病理状态密切相关¹⁷。然而，与宿主中微生物种群的组成和功能网络相关的研究非常困难，因为每个自然个体中微生物的组成并不完全相同.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56