Optimierung der Aufzucht keimfreier Wespen

Zusammenfassung

Nasonia-Wespenembryonen wurden nach 12-24 h Parasitierung von Lucillia sericata-Puppen präpariert und mit Alkohol und 10%iger Natriumhypochloritlösung gewaschen, um keimfreie Embryonen zu erhalten. Nach der Aufzucht der keimfreien Embryonen und der Versorgung mit Nasonia-Aufzuchtmedium zum Wachsen und Entwickeln in vitro wurden keimfreie Nasonia-Imagines erhalten.

Zusammenfassung

Die aseptische Aufzuchttechnologie ist eine Methode zur Kultivierung von Insekten unter sterilen oder nahezu sterilen Bedingungen, die den Einfluss externer Mikroorganismen auf die Insektenmikrobiota effektiv eliminieren und so die schnelle Entwicklung der Insektenmikrobiota-Forschung fördern kann. Nasonia (Wespengattung) ist ein parasitäres Wespeninsekt, das viele Vorteile hat, wie z.B. eine kurze Lebensdauer, hohe genetische Variation, einfache Bedienung usw., und als Insektenmodellsystem weit verbreitet ist. Im Gegensatz zur Antibiotikabehandlung, die nur die Anzahl der Mikroorganismen bei Tieren reduzieren kann, können aseptische Aufzuchttechniken sowohl die Zusammensetzung als auch die Menge der Mikroorganismen in Tieren kontrollieren, was die Untersuchung von Wirt-Mikroben-Interaktionen weiter erleichtert. Frühere Versionen des Nasonia-Aufzuchtmediums (NRM) weisen jedoch einige Mängel und Probleme auf, wie z. B. einen komplexen und zeitaufwändigen Zubereitungsprozess, eine leichte Kontamination durch Bakterien oder Pilze und eine kurze Lagerzeit. Daher löst diese Studie diese Probleme, indem sie die im NRM-Vorbereitungsprozess verwendeten Werkzeuge, die Lagerbedingungen und die Komponentenverhältnisse optimiert. Das optimierte Medium könnte eine Lagerung bei -20 °C für mindestens 3 Monate ermöglichen und die Möglichkeit einer NRM-Kontamination bei der Fütterung steriler Wespen ausschließen. Dies verbessert die Überlebensrate und das Gesundheitsniveau von aseptischem Nasonia weiter, was wichtig ist, um Nasonia als Modell für die mikrobielle Forschung zu nutzen.

Einleitung

Keimfreie Tiere sind Tiere, die keine nachweisbaren lebenden Mikroorganismen und Parasiten^{aufweisen 1}. Keimfreie Embryonen können gewonnen werden, indem die Mutter unter aseptischen Bedingungen präpariert und anschließend in Barrieresystemen aufgezogen wird². Solche Tiere können verwendet werden, um die Auswirkungen von Mikroorganismen auf Tiere zu untersuchen, z. B. auf die Darmmikrobiota, das Immunsystem und den Stoffwechsel¹. Mit bestimmten technischen Mitteln können viele Insekten und sogar Säugetiere unfruchtbar gemacht werden ^3,4. Keimfreie Tiere spielen eine einzigartige Rolle und werden in verschiedenen Aspekten der mikrobiologischen Forschung eingesetzt⁵. So hat beispielsweise der Einsatz von keimfreien Nasonia-Wespen gezeigt, dass Mikroorganismen Wirten helfen können, sich unter langfristigem exogenem Umweltstress an neue Umgebungen anzupassen ^6,7.

Nasonia-Parasitoide sind kleine Schlupfwespen, die ihre Eier in die Puppen von Fliegen injizieren⁴. Es gibt vier bekannte Arten von Nasonia, darunter Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti und Nasonia oneida⁸. N. vitripennis kommt weltweit vor, während die anderen drei Arten nur begrenzte Verbreitungsgebiete in Nordamerika haben⁴. Nasonia-Schlupfwespen gelten aufgrund ihrer Eigenschaften wie einfache Kultivierung, kurzer Fortpflanzungszyklus, sequenziertes Genom und Langzeitdiapause als ideale Modellinsekten ^8,9. Sie können verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Evolution, Genetik, Entwicklung, des Verhaltens und der Symbiose von Insekten zu untersuchen¹⁰. Darüber hinaus können Nasonia-Schlupfwespen auch dazu beitragen, schädliche Fliegen in der Landwirtschaft und Krankheiten zu bekämpfen¹¹. Die erfolgreiche Etablierung eines sterilen Insektensystems umfasst zwei Hauptschritte: (1) die Sterilisation der Embryonen und (2) die Versorgung der Larven mit steriler Nahrung in vitro. Um steriles Futter zu erhalten, entwickelten Brucker und Bordenstein 12 im Jahr 2012 das Nasonia-Aufzuchtmedium (NRMv1), indem sie Chemikalien wie Antibiotika, Bleichmittel und fötales Kälberserum einsetzten, um Bakterien abzutöten¹². Die chemische Sterilisationsmethode führte jedoch zu niedrigen Überlebens- und Eklosionsraten von N. vitripennis¹³. Im Jahr 2016 entwickelten Shropshire et al. dann NRMv2, indem sie eine Filtersterilisationsmethode anstelle einer chemischen Sterilisationsmethode verwendeten, um die Gefahren von Antibiotika und anderen Substanzen zu eliminieren, und optimierten den Züchtungsprozess¹³. Leider hat diese Methode immer noch einige Nachteile, wie z. B. die Herausforderungen, die mit der Vorbereitung und Verwendung des Mediums verbunden sind, sowie die Risiken des Ertrinkens, der Unterernährung oder der Dehydrierung für die Embryonen, Larven und geschlossenen Puppen¹⁴. Wang und Brucker¹⁴ haben kürzlich die Protokolle Nasonia Aufzuchtmedien Version 3 (NRMv3) und die keimfreie Aufzucht Version 2 (GFRv2) verbessert. Diese Verbesserungen reduzierten die Kosten und den Medienverbrauch. Der NRMv3 hat jedoch eine sehr kurze Lagerzeit und ist sehr anfällig für Verunreinigungen.

Aufbauend auf NRMv3 wurden in dieser Studie die Lagerungsmethode und das Nährstoffverhältnis des NRM-Präparationswerkzeugs optimiert. Diese methodische Verfeinerung ermöglicht es, N. vitripennis als Modell für Mikrobiomstudien zu verwenden. Im Vergleich zu dem von Wang et al.14 entwickelten NRMv3 verbessert das verbesserte Werkzeug zum Auspressen von Sarcophaga bullata-Puppen, einem der NRM-Rohstoffe, die Produktionseffizienz von S. bullata-Puppengewebeflüssigkeit im Vergleich zu der von Wang et ^al.14 verwendeten 60-ml-Spritze mit einem Bodenloch erheblich. Wir passten das Nährstoffverhältnis von NRM an, was zu einer gewissen Erhöhung der Überlebensrate von keimfreien Nasonia-Wespen führte, ohne ihre Entwicklungszeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde das NRM in Zentrifugenröhrchen mit kleinem Fassungsvermögen (1,5 ml) verpackt und in einem Kühlschrank bei -20 °C eingefroren, um die Lagerzeit zu verlängern. Es ist erwähnenswert, dass wir zwar die Stubenfliege Lucilia sericata als Wirt und Quelle für die NRM-Präparation verwendet haben, dieses Protokoll jedoch wahrscheinlich für andere Nasonia-Wirte, die im Labor verfügbar sind, angepasst werden kann.

Protokoll

1. Aufbereitung von keimfreiemNasonia-Aufzuchtmedium 

1. Legen Sie die handelsüblichen L. sericata-Puppen (siehe Materialtabelle) auf eine Oberfläche, die alle Puppen aufnehmen kann, z. B. ein Tablett oder ein Blatt Papier. Entsorgen Sie unterentwickelte Larven, dunkle alte Puppen, leere Puppenschalen, Sägemehl oder andere Verunreinigungen. Behalten Sie nur junge, bräunlich-rot gefärbte Puppen und geben Sie sie in einen Becher (ca. 3.000-4.000 Puppen).
   HINWEIS: Nach vielen Experimenten wurde festgestellt, dass das aus den dunklen alten Puppen hergestellte Medium leicht dunkel wurde und die Entwicklung keimfreier Wespen stoppte. Dieses Phänomen trat bei der Verwendung der jungen bräunlich-roten Puppen zur Herstellung von Medium nicht auf. Der Grund dafür ist noch unklar und bedarf weiterer Untersuchungen, um ihn zu überprüfen.
2. Geben Sie so viel deionisiertes Wasser in das Becherglas, dass die gesamte Oberfläche der Puppen bedeckt ist. Wickeln Sie die Öffnung des Bechers mit Alufolie oder Gaze ein, schütteln Sie den Becher, um die Verunreinigungen auf der Oberfläche der Puppen zu entfernen, und gießen Sie dann das Wasser aus. Wiederholen Sie dies drei- bis fünfmal.
3. Legen Sie die gereinigten L. sericata-Puppen in den Filtertank einer Knoblauchpresse, drücken Sie sie fest aus und sammeln Sie die Gewebeflüssigkeit der L. sericata-Puppen in einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen . Gießen Sie dann den Puppensatz aus und geben Sie neue Puppen in den Filtertank der Knoblauchpresse, bis alle ausgepresst sind.
   Anmerkungen: Im Vergleich zu dem von Wang et ^al.14 verwendeten Nadelextrusionsgerät ist die Knoblauchpresse bequemer und kann die interstitielle Flüssigkeit gründlicher trennen. Diese Weiterentwicklung legt den Grundstein für die großtechnische Produktion und Langzeitlagerung von NRM.
4. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4 °C (25.000 x g) für 10 min. Nach der Zentrifugation wird das Gemisch von unten nach oben in drei Schichten getrennt: Sedimentschicht, Proteinschicht und Fettschicht (Abbildung 1).
5. Um ein Verstopfen während der Filtration zu vermeiden, saugen Sie die Proteinschicht mit einer sterilen 18-G-Nadel ab und übertragen Sie sie in ein neues konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus sterilem Polypropylen.
6. Fügen Sie dem Proteinextrakt handelsübliches flüssiges Drosophila-Medium (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1 hinzu.
   HINWEIS: Im Vergleich zu NRMv3 wurde zweckmäßiger kommerzialisiertes L. sericata als Wirts- und NRM-Rohstoff verwendet. Daher wurde das Nährstoffverhältnis von 1:2 auf 1:1 basierend auf NRMv3 angepasst, das für das Wachstum und die Entwicklung steriler Nasonia besser geeignet war (Abbildung 2).
7. Filtern Sie das Mischmedium (Drosophila-Medium und Proteinextrakt aus L. sericata-Puppe ) mit einem Vakuumfiltrationssystem mit unterschiedlichen Porengrößen (8, 1,2, 0,8 und 0,45 μm; siehe Materialtabelle), um Partikel unterschiedlicher Größe zu entfernen. Um Verstopfungen zu vermeiden, wechseln Sie das Filterpapier, wenn sich der Durchfluss verlangsamt.
   HINWEIS: Für jede Filtration ist die Verwendung eines neuen sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchens erforderlich.
8. Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit erneut bei 4 °C (15.000 x g) für 10 min und sterilisieren Sie das überstehende Medium durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter. Wiederholen Sie die obigen Schritte einmal.
9. Lagern Sie das Nährmedium nach der Aliquotierung bei -20 °C (Abbildung 3A) zur Langzeitlagerung.
   Anmerkungen: Um eine Kontamination und wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden, wird empfohlen, jedes Röhrchen NRM nur einmal zu öffnen, wenn das Nährmedium nach dem Verpacken verwendet wird (Abbildung 3A).

2. Keimfreie Eizellentnahme

1. Um ein stabiles Verhältnis von Männchen zu Weibchen bei den Nachkommen zu gewährleisten, werden die Puppen während des Puppenstadiums in einem Verhältnis von 50 Weibchen zu 15 Männchen in ein Drosophila-Fläschchen gegeben, da sie haploide genetische Merkmale aufweisen (Männchen entwickeln sich aus haploiden Zellen, während Weibchen sich aus diploiden Zellen entwickeln, die aus befruchteten Eiern hervorgehen)^4,15.
   1. Lassen Sie die Männchen und Weibchen nach dem Schlüpfen zu erwachsenen Tieren 1,5 Tage lang paaren und geben Sie dann etwa 40 L. sericata-Puppen in die Durchstechflasche. Innerhalb von 12-24 Stunden nach der Parasitierung wird mit einer sterilen Präpariernadel vorsichtig ein Ende der Puppenschale unter einem Stereomikroskop geöffnet (Abbildung 4).
   2. Halten Sie das andere Ende mit der Hand und finden Sie die Wespenembryonen. Verwenden Sie eine Präpariernadel, um Embryonen von der Oberfläche des Puppengewebes von L. sericata in ein steriles Zellsieb mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu ^{übertragen14}.
      HINWEIS: Ältere L. sericata-Puppen sollten bei Parasitismus verwendet werden, da das trockene Puppengewebe von L. sericata leichter zu übertragen ist. Um einen reibungslosen Transfer der Eier von der Gewebeoberfläche der L. sericata-Puppe zu gewährleisten, achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu punktieren, wenn die Präpariernadel die Puppenhülle öffnet, damit die interstitielle Flüssigkeit nicht herausfließt.
2. Legen Sie 20-30 Embryonen auf ein Zellsieb und waschen Sie sie gleichmäßig mit 1.000 μl 10%iger handelsüblicher Natriumhypochloritlösung (siehe Materialtabelle), gefolgt von einer weiteren Wäsche mit 1.000 μl 1x sterilem PBS. Anschließend einmal mit 1.000 μl 70%iger Ethanollösung waschen und dreimal mit 1.000 μl 1x sterilem PBS waschen.
3. Legen Sie zunächst eine mit 1x PBS vorbenetzte Polypropylen-Gitterbahn mit 5 mm Durchmesser (siehe Materialtabelle) in eine 24-Well-Platte. Bürsten Sie dann mit einer sterilisierten kleinen Bürste die Wespenembryonen auf dem Zellsieb vorsichtig auf die Polypropylen-Netzplatte. Dies kann für alle vier Wells in einer vertikalen Spalte der 24-Well-Platte erfolgen.

3. Keimfreie Wespenaufzucht

1. Geben Sie 50 μl NRM in jede Vertiefung in einer Laminar-Flow-Haube. Um eine feuchte Umgebung für das Wachstum aufrechtzuerhalten, fügen Sie 1 ml steriles Wasser zwischen jede Vertiefung in der 24-Well-Platte hinzu. Ein kleiner Becher mit 30 ml sterilem Wasser kann auch in die sterile 5-Liter-Kunststoffbox mit der 24-Well-Platte gegeben werden.
   1. Bewahren Sie die sterile Kunststoffbox und die 24-Well-Platte während des gesamten Experiments in einer Klimakammer bei einer konstanten Temperatur von 25 ± 2 °C und unter konstantem Licht auf.
2. Vor dem täglichen Übertragen und Hinzufügen von NRM tauen Sie das gefrorene NRM auf einer Laminar-Flow-Bank auf. Verwenden Sie in einer sterilen Umgebung eine mit Alkohol desinfizierte Pinzette, um das Polypropylennetz mit den Larven von einer Vertiefung in eine andere zu übertragen. Zum Schluss werden 50 μl NRM hinzugefügt, das auf Raumtemperatur ausgeglichen wurde (Abbildung 3B). Wiederholen Sie die oben genannten Vorgänge jeden Tag, bis die Puppen beobachtet werden.
   HINWEIS: Mit der Entwicklung von Wespen sollte die Menge an NRM entsprechend erhöht werden, um sicherzustellen, dass die keimfreien Wespen ausreichend Nahrung erhalten. So wurden beispielsweise die Larven im vierten Stadium mit 60 bis 70 μL NRM versorgt. Da verschiedene Entwicklungsstadien im selben Brunnen nebeneinander existieren können, verwenden Sie eine sterilisierte Bürste, um die Puppen zu übertragen. Fügen Sie den restlichen Larven eine kleine Menge NRM hinzu. Verwenden Sie aseptische Techniken, um das Eindringen von Mikroorganismen und die Verschmutzung zu vermeiden.
3. Nach 9 bis 11 Tagen Fütterung entwickeln sich mehr als 80% der Larven zu weißen oder gelben Puppen. Bewegen Sie den Filter zu diesem Zeitpunkt in eine Clean-Well-Platte und hören Sie auf, Nährmedium hinzuzufügen, um auf die Eklosion zu warten.

Ergebnisse

Die Präparationseffizienz von NRM wurde durch die Verbesserung der Präparationswerkzeuge erheblich verbessert. Darüber hinaus wurde das Problem der NRM-Verschmutzung im Fütterungsprozess durch die Optimierung der Strategie und der Konservierungsmethode beseitigt. Gleichzeitig hatte die adjustierte NRM ein geeigneteres Nährstoffverhältnis für das Wachstum und die Entwicklung keimfreier Wespen mit L. sericata als Wirt. Die Überlebensrate keimfreier Wespen von der Larve bis zur Puppe war im Vergleich zu kei...

Diskussion

Mit der Anwendung von Hochdurchsatz-Nachweistechnologien wie Genomik und Metabolomik haben Forscher allmählich erkannt, dass es in der Darmmikrobiota eine enorme genetische Vielfalt und metabolische Komplexität gibt¹⁶. Diese symbiotischen Bakterien stehen in engem Zusammenhang mit verschiedenen physiologischen oder pathologischen Zuständen wie dem Ernährungsstoffwechsel des Wirts, Tumoren, Immunität und Alterung durch komplexe Interaktionen mit dem Wirt¹⁷. Die Erforsch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56