Otimizando o procedimento de criação de vespas livres de germes

Resumo

Embriões de vespas Nasonia foram dissecados de pupas de Lucillia sericata após parasitização por 12-24 h e lavados com álcool e solução de hipoclorito de sódio a 10% para obtenção de embriões livres de germes. Após a criação dos embriões livres de germes e fornecimento de meio de criação de Nasonia para crescimento e desenvolvimento in vitro, adultos de Nasonia livres de germes foram obtidos.

Resumo

A tecnologia de criação asséptica é um método de cultivo de insetos em condições estéreis ou quase estéreis, que pode efetivamente eliminar a influência de microrganismos externos na microbiota de insetos e, assim, promover o rápido desenvolvimento da pesquisa da microbiota de insetos. Nasonia (gênero vespa) é um inseto vespa parasita que tem muitas vantagens, como uma vida curta, alta variação genética, fácil operação, etc., e é amplamente utilizado como um sistema modelo de insetos. Ao contrário do tratamento com antibióticos, que só pode reduzir o número de microrganismos em animais, as técnicas de criação asséptica podem controlar tanto a composição quanto a quantidade de microrganismos em animais, facilitando ainda mais o estudo das interações hospedeiro-micróbio. No entanto, as versões anteriores do meio de criação Nasonia (NRM) têm alguns defeitos e problemas, como um processo de preparação complexo e demorado, fácil contaminação por bactérias ou fungos e curto tempo de armazenamento. Portanto, este estudo resolve esses problemas otimizando as ferramentas usadas no processo de preparação da NRM, as condições de armazenamento e as proporções de componentes. O meio otimizado pode permitir o armazenamento a -20 °C por pelo menos 3 meses e eliminar a possibilidade de contaminação por NRM durante a alimentação de vespas estéreis. Isso melhora ainda mais a taxa de sobrevivência e o nível de saúde da nasonia asséptica, que é importante para o uso de Nasonia como um modelo para a pesquisa microbiana.

Introdução

Animais livres de germes são animais que não apresentam microrganismos vivos e parasitas detectáveis¹. Embriões livres de germes podem ser obtidos dissecando a mãe em condições assépticas e posteriormente criados em sistemas de barreira². Esses animais podem ser utilizados para estudar os efeitos de microrganismos em animais, como na microbiota intestinal, no sistema imunológico e no metabolismo¹. Com certos meios técnicos, muitos insetos e até mamíferos podem se tornar estéreis ^3,4. Animais livres de germes têm um papel único e têm sido amplamente utilizados em vários aspectos da pesquisa em microbiologia⁵. Por exemplo, o uso de vespas Nasonia livres de germes revelou que microrganismos podem ajudar os hospedeiros a se adaptarem a novos ambientes sob estresse ambiental exógeno de longo prazo ^6,7.

Nasonia parasitoides são pequenas vespas parasitas que injetam seus ovos nas pupas de moscas⁴. Existem quatro espécies conhecidas de Nasonia, incluindo Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti e Nasonia oneida⁸. N. vitripennis pode ser encontrada em todo o mundo, enquanto as outras três espécies têm distribuição limitada na América do^Norte4. As vespas parasitoides Nasonia são consideradas insetos modelo ideal devido às suas características, como fácil cultivo, ciclo reprodutivo curto, genoma sequenciado e diapausa de longa duração ^8,9. Eles podem ser usados para estudar vários aspectos da evolução de insetos, genética, desenvolvimento, comportamento e simbiose¹⁰. Além disso, vespas parasitoides Nasonia também podem ajudar a controlar moscas nocivas na agricultura e doenças¹¹. O estabelecimento bem-sucedido de um sistema de insetos estéreis envolve duas etapas principais: (1) esterilização dos embriões e (2) fornecimento de alimento estéril para as larvas in vitro. Para obter alimentos estéreis, Brucker e Bordenstein 12 desenvolveram, em 2012, o meio de criação de Nasonia (NRMv1), utilizando produtos químicos como antibióticos, água sanitária e soro fetal bovino para matar bactérias¹². Entretanto, o método de esterilização química resultou em baixas taxas de sobrevivência e eclosão de N. vitripennis¹³. Então, em 2016, Shropshire e col. desenvolveram a NRMv2 usando um método de esterilização por filtro em vez de um método de esterilização química para eliminar os perigos de antibióticos e outras substâncias, e otimizaram o processo de melhoramento¹³. Infelizmente, esse método ainda apresenta algumas desvantagens, como os desafios associados ao preparo e uso do meio, bem como os riscos de afogamento, subalimentação ou desidratação para os embriões, larvas e pupas fechadas¹⁴. Wang e Brucker¹⁴ recentemente melhoraram os protocolos de criação de Nasonia versão 3 (NRMv3) e de criação livre de germes versão 2 (GFRv2). Essas melhorias reduziram o custo e o consumo de mídia. No entanto, o NRMv3 tem um tempo de armazenamento muito curto e é altamente suscetível à contaminação.

Com base na NRMv3, o método de armazenamento da ferramenta de preparo NRM e a proporção de nutrientes foram otimizados neste estudo. Esse refinamento metodológico facilita o uso de N. vitripennis como modelo para estudos de microbioma. Em comparação com a NRMv3 desenvolvida por Wang et al.14, a ferramenta aprimorada para espremer a pupa de Sarcophaga bullata, uma das matérias-primas da NRM, aumenta consideravelmente a eficiência de produção do fluido tecidual de pupa de S. bullata em comparação com a seringa de 60 mL com orifício de fundo usada por Wang et ^al.14. Nós ajustamos a proporção de nutrientes da NRM, o que levou a um certo aumento na taxa de sobrevivência de vespas Nasonia livres de germes sem afetar seu tempo de desenvolvimento. Além disso, o MRN foi acondicionado em tubos de centrífuga de pequena capacidade (1,5 mL) e congelado em refrigerador de -20 °C para prolongar o tempo de armazenamento. Vale a pena notar que, embora tenhamos usado a mosca doméstica Lucilia sericata como hospedeiro e fonte para a preparação da NRM, este protocolo provavelmente pode ser adaptado para outros hospedeiros de Nasonia que estão disponíveis no laboratório.

Protocolo

1. Preparação de meio de criação de Nasonia livre de germes 

1. Coloque as pupas de L. sericata disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais) em uma superfície que possa acomodar todas as pupas, como uma bandeja ou uma folha de papel. Descarte quaisquer larvas subdesenvolvidas, pupas velhas escuras, conchas de pupas vazias, serragem ou outras impurezas. Mantenha apenas pupas jovens de cor vermelho-acastanhada e transfira-as para um copo (aproximadamente 3.000-4.000 pupas).
   NOTA: Depois de realizar muitos experimentos, descobriu-se que o meio feito a partir das pupas velhas escuras facilmente se tornou escuro e parou o desenvolvimento de vespas livres de germes. Esse fenômeno não ocorreu quando se utilizou as pupas jovens vermelho-acastanhadas para produzir o meio. A razão para isso ainda não está clara e requer mais investigação para verificá-la.
2. Adicione água deionizada suficiente ao copo para cobrir toda a superfície das pupas. Envolva a boca do copo com papel alumínio ou gaze, agite o copo para limpar as impurezas na superfície das pupas e, em seguida, despeje a água. Repita de três a cinco vezes.
3. Coloque as pupas de L. sericata limpas no tanque de filtro de uma prensa de alho, esprema com força e colete o fluido de tecido das pupas de L. sericata em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL . Em seguida, despeje a borra de pupa e coloque novas pupas no tanque de filtro da prensa de alho até que todas estejam espremidas.
   NOTA: Em comparação com o dispositivo de extrusão com agulha utilizado por Wang et ^al.14, a prensa de alho é mais conveniente e pode separar o líquido intersticial mais completamente. Esse avanço estabelece as bases para a produção em larga escala e o armazenamento de longo prazo do NRM.
4. Centrifugar a mistura a 4 °C (25.000 x g) por 10 min. Após a centrifugação, a mistura será separada em três camadas, de fundo para cima: camada de sedimento, camada de proteína e camada de gordura (Figura 1).
5. Para evitar entupimento durante a filtração, aspirar a camada de proteína usando uma agulha estéril de 18 G e transferi-la para um novo tubo centrífugo de polipropileno estéril cônico de 50 mL.
6. Adicione meio líquido comercial de Drosophila (ver Tabela de Materiais) ao extrato proteico na proporção de 1:1.
   NOTA: L. sericata comercializada mais conveniente foi usada como matéria-prima hospedeira e NRM, em comparação com NRMv3. Portanto, a razão nutricional foi ajustada de 1:2 para 1:1 com base na NRMv3, que foi mais adequada para o crescimento e desenvolvimento de Nasonia estéril (Figura 2).
7. Filtrar o meio misto (meio de Drosophila e extrato proteico de pupa de L. sericata ) usando um sistema de filtração a vácuo com diferentes tamanhos de poros (8, 1,2, 0,8 e 0,45 μm; ver Tabela de Materiais) para remover partículas de diferentes tamanhos. Para evitar entupimentos, troque o papel de filtro quando o fluxo diminuir.
   NOTA: O uso de um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL é necessário para cada filtração.
8. Centrifugar o líquido novamente a 4 °C (15.000 x g) por 10 min e esterilizar o meio sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22 μm. Repita as etapas acima uma vez.
9. Conservar o meio de cultura a -20 °C após alíquota (Figura 3A) para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: Para evitar contaminação e repetidos congelamentos e descongelamentos, recomenda-se abrir cada tubo de NRM apenas uma vez ao utilizar o meio de cultura após a embalagem (Figura 3A).

2. Coleta de ovos sem germes

1. Para garantir uma relação macho/fêmea estável na prole, coloque as pupas em um frasco de Drosophila durante a fase de pupa em uma proporção de 50 fêmeas para 15 machos devido às suas características genéticas haploides (os machos se desenvolvem a partir de células haploides, enquanto as fêmeas se desenvolvem a partir de células diploides que resultam de ovos fertilizados)^4,15.
   1. Depois de emergir para adultos, deixe os machos e fêmeas acasalarem por 1,5 dias e, em seguida, coloque cerca de 40 pupas de L. sericata no frasco. Dentro de 12-24 h após a parasitização, utilizar uma agulha dissecante estéril para abrir cuidadosamente uma extremidade da concha pupal sob um estereomicroscópio (Figura 4).
   2. Segure a outra extremidade com a mão e encontre os embriões de vespa. Utilizar agulha dissecante para transferir embriões da superfície do tecido de pupa de L. sericata para filtro celular estéril com solução salina tamponada com fosfato (PBS)¹⁴.
      NOTA: Pupas mais antigas de L. sericata devem ser usadas para parasitismo, pois o tecido seco da pupa de L. sericata é mais fácil de transferir embriões . A fim de garantir a transferência suave de ovos da superfície do tecido de L. sericata pupa, tente ter cuidado para não puncionar o tecido quando a agulha dissecante abrir o estojo pupal para que o líquido intersticial não flua.
2. Colocar 20-30 embriões em um filtro de células e lavá-los uniformemente com 1.000 μL de solução comercial de hipoclorito de sódio a 10% (ver Tabela de Materiais), seguido de outra lavagem com 1.000 μL de 1x PBS estéril. Em seguida, lavar uma vez com 1.000 μL de solução de etanol a 70% e lavar três vezes com 1.000 μL de PBS 1x estéril.
3. Primeiro, coloque uma folha de malha de polipropileno de 5 mm de diâmetro (consulte Tabela de Materiais) que foi pré-molhada com 1x PBS em uma placa de 24 poços. Em seguida, usando uma pequena escova esterilizada, escove suavemente os embriões de vespa no filtro de células sobre a folha de malha de polipropileno. Isso pode ser feito para todos os quatro poços em uma coluna vertical da placa de 24 poços.

3. Criação de vespas livres de germes

1. Adicionar 50 μL de NRM a cada poço em uma capela de fluxo laminar. Para manter um ambiente úmido para o crescimento, adicione 1 mL de água estéril entre cada poço na placa de 24 poços. Um copo pequeno contendo 30 mL de água estéril também pode ser colocado na caixa de plástico estéril de 5 L com a placa de 24 poços.
   1. Durante todo o experimento, mantenha a caixa plástica estéril e a placa de 24 poços em uma câmara climática a uma temperatura constante de 25 ± 2 °C e sob luz constante.
2. Antes de transferir e adicionar NRM todos os dias, descongele o NRM congelado em uma bancada de fluxo laminar. Em um ambiente estéril, use pinças desinfetadas com álcool para transferir a tela de polipropileno com larvas de um poço para outro. Por fim, adicionar 50 μL de NRM que foi equilibrado à temperatura ambiente (Figura 3B). Repita as operações acima todos os dias até que as pupas sejam observadas.
   NOTA: Com o desenvolvimento de vespas, a quantidade de NRM deve ser aumentada adequadamente para garantir que as vespas livres de germes tenham nutrição suficiente. Por exemplo, as larvas de quarto ínstar foram fornecidas com 60 a 70 μL de NRM. Como diferentes estágios de desenvolvimento podem coexistir no mesmo poço, use uma escova esterilizada para transferir as pupas. Adicione uma pequena quantidade de NRM às larvas restantes. Use técnicas assépticas para evitar a invasão microbiana e a poluição.
3. Após a alimentação por 9 a 11 dias, mais de 80% das larvas se desenvolvem em pupas brancas ou amarelas. Neste momento, mova o filtro para uma placa de poço limpa e pare de adicionar meio de cultura para aguardar a eclosão.

Resultados

A eficiência de preparação do NRM foi muito melhorada através da melhoria das ferramentas de preparação. Além disso, o problema da poluição por NRM no processo de alimentação foi eliminado otimizando a estratégia e o método de preservação. Ao mesmo tempo, o MRN ajustado apresentou uma razão nutricional mais adequada para o crescimento e desenvolvimento de vespas livres de germes com L. sericata como hospedeiros. A taxa de sobrevivência de vespas livres de germes de larvas para pupas foi signific...

Discussão

Com a aplicação de tecnologias de detecção de alto rendimento, como genômica e metabolômica, os pesquisadores gradualmente perceberam que há uma enorme diversidade genética e complexidade metabólica na microbiota intestinal¹⁶. Essas bactérias simbióticas estão intimamente relacionadas a vários estados fisiológicos ou patológicos, como metabolismo nutricional do hospedeiro, tumores, imunidade e envelhecimento por meio de interações complexas com o hospedeiro¹⁷

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56