حبات معدلة بالبورفيرين لاستخدامها كضوابط تعويض في قياس التدفق الخلوي

Summary

يصف البروتوكول كيفية تحضير حبات التعويض القائمة على البورفيرين لقياس التدفق الخلوي عن طريق تفاعل حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين مع البورفيرين TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC. يتم استخدام إجراء الترشيح لتقليل المنتجات الثانوية للجسيمات.

Abstract

يمكن لقياس التدفق الخلوي توصيف وقياس مجموعات الخلايا المتنوعة بسرعة بناء على قياسات مضان. يتم تلطيخ الخلايا أولا بواحد أو أكثر من الكواشف الفلورية ، كل منها يعمل بجزيء فلوري مختلف (فلوروفور) يرتبط بالخلايا بشكل انتقائي بناء على خصائصها المظهرية ، مثل تعبير مستضد سطح الخلية. يمكن قياس شدة التألق من كل كاشف مرتبط بالخلايا على مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات التي تكتشف نطاقا محددا من الأطوال الموجية. عند استخدام العديد من الفلوروفورات ، غالبا ما يمتد الضوء من الفلوروفورات الفردية إلى قنوات الكشف غير المرغوب فيها ، الأمر الذي يتطلب تصحيحا لبيانات شدة التألق في عملية تسمى التعويض.

هناك حاجة إلى جزيئات التحكم في التعويض ، وعادة ما تكون حبات البوليمر المرتبطة بفلوروفور واحد ، لكل فلوروفور يستخدم في تجربة وضع العلامات على الخلايا. تستخدم البيانات من جزيئات التعويض من مقياس التدفق الخلوي لتطبيق تصحيح لقياسات شدة التألق. يصف هذا البروتوكول تحضير وتنقية حبات تعويض البوليسترين التي تعمل تساهميا مع الكاشف الفلوري meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) وتطبيقها في تعويض قياس التدفق الخلوي. في هذا العمل ، تمت معالجة حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين باستخدام TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) عند الرقم الهيدروجيني 6 وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة مع التقليب. تم عزل حبات TCPP عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت pH 7 للتخزين. لوحظت الجسيمات المرتبطة ب TCPP كمنتج ثانوي. يمكن تقليل عدد هذه الجسيمات باستخدام بروتوكول ترشيح اختياري. تم استخدام حبات TCPP الناتجة بنجاح على مقياس التدفق الخلوي للتعويض في التجارب مع خلايا البلغم البشرية الموسومة بفلوروفورات متعددة. أثبتت حبات TCPP أنها مستقرة بعد تخزينها في الثلاجة لمدة 300 يوم.

Introduction

كانت البورفيرينات ذات أهمية لسنوات عديدة في المجال الطبي الحيوي بسبب مضانها وخصائصها التي تستهدف الورم^1،2،3. تستلزم التطبيقات العلاجية مثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) والعلاج بالموجات فوق الصوتية (SDT) الإدارة الجهازية للبورفيرين لمريض السرطان ، وتراكم الدواء في الورم ، والتعرض الموضعي للورم لضوء ليزر بطول موجي محدد أو الموجات فوق الصوتية. يؤدي التعرض لضوء الليزر أو الموجات فوق الصوتية إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة البورفيرين وموت الخلايا اللاحق ^4,5. في التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) ، يستخدم مضان البو....

Protocol

يجب القيام بجميع الإجراءات باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. تحضير محلول مخزون TCPP ، 1.0 مجم / مل

ملاحظة: يمكن إعداد هذا شهريا.

1. باستخدام ميزان تحليلي وملعقة وورق وزن ، تزن 49.0-50.9 مجم من TCPP. تقريب الوزن إلى 1/10 ملليغرام. اضبط الكمية المقاسة من TCPP جانبا محمية من الضوء.
   ملاحظة: استخدم مسدسا ثابتا إذا كانت قراءة الوزن غير مستقرة.
2. حدد الكميات المطلوبة من الماء النقي والأيزوبروبانول (IPA) من الجدول 1 بناء على كمية TCPP التي تم وزنها في الخطوة 1.1. أضف الماء النقي والأيزوبروبانول إلى دورق زجاجي سعة 100 مل ، وقم بتغطيته ببارافيلم للحماية من التبخ....

النتائج

هذا البروتوكول لوضع العلامات TCPP للخرز سريع وفعال نسبيا. يوضح الشكل 1 نتيجة تمثيلية لعملية وضع العلامات على حبيبات TCPP كما هو محدد بواسطة قياس التدفق الخلوي. يوضح الشكل 1 أ المظهر الجانبي القياسي لخرز قوس قزح ، كما تم اكتشافه في القناة المناسبة للكشف عن TCPP. تعم.......

Discussion

على الرغم من التطبيقات العديدة للبورفيرينات في تشخيص السرطان وعلاجاته² ، إلا أن هناك أدبيات محدودة حول استخدامها المحتمل ككاشف لقياس التدفق الخلوي لتحديد مجموعات الخلايا السرطانية مقابل غير السرطانية في الأنسجة البشرية الأولية²⁴،^25،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365