Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول كيفية تحضير حبات التعويض القائمة على البورفيرين لقياس التدفق الخلوي عن طريق تفاعل حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين مع البورفيرين TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC. يتم استخدام إجراء الترشيح لتقليل المنتجات الثانوية للجسيمات.

Abstract

يمكن لقياس التدفق الخلوي توصيف وقياس مجموعات الخلايا المتنوعة بسرعة بناء على قياسات مضان. يتم تلطيخ الخلايا أولا بواحد أو أكثر من الكواشف الفلورية ، كل منها يعمل بجزيء فلوري مختلف (فلوروفور) يرتبط بالخلايا بشكل انتقائي بناء على خصائصها المظهرية ، مثل تعبير مستضد سطح الخلية. يمكن قياس شدة التألق من كل كاشف مرتبط بالخلايا على مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات التي تكتشف نطاقا محددا من الأطوال الموجية. عند استخدام العديد من الفلوروفورات ، غالبا ما يمتد الضوء من الفلوروفورات الفردية إلى قنوات الكشف غير المرغوب فيها ، الأمر الذي يتطلب تصحيحا لبيانات شدة التألق في عملية تسمى التعويض.

هناك حاجة إلى جزيئات التحكم في التعويض ، وعادة ما تكون حبات البوليمر المرتبطة بفلوروفور واحد ، لكل فلوروفور يستخدم في تجربة وضع العلامات على الخلايا. تستخدم البيانات من جزيئات التعويض من مقياس التدفق الخلوي لتطبيق تصحيح لقياسات شدة التألق. يصف هذا البروتوكول تحضير وتنقية حبات تعويض البوليسترين التي تعمل تساهميا مع الكاشف الفلوري meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) وتطبيقها في تعويض قياس التدفق الخلوي. في هذا العمل ، تمت معالجة حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين باستخدام TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) عند الرقم الهيدروجيني 6 وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة مع التقليب. تم عزل حبات TCPP عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت pH 7 للتخزين. لوحظت الجسيمات المرتبطة ب TCPP كمنتج ثانوي. يمكن تقليل عدد هذه الجسيمات باستخدام بروتوكول ترشيح اختياري. تم استخدام حبات TCPP الناتجة بنجاح على مقياس التدفق الخلوي للتعويض في التجارب مع خلايا البلغم البشرية الموسومة بفلوروفورات متعددة. أثبتت حبات TCPP أنها مستقرة بعد تخزينها في الثلاجة لمدة 300 يوم.

Introduction

كانت البورفيرينات ذات أهمية لسنوات عديدة في المجال الطبي الحيوي بسبب مضانها وخصائصها التي تستهدف الورم1،2،3. تستلزم التطبيقات العلاجية مثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) والعلاج بالموجات فوق الصوتية (SDT) الإدارة الجهازية للبورفيرين لمريض السرطان ، وتراكم الدواء في الورم ، والتعرض الموضعي للورم لضوء ليزر بطول موجي محدد أو الموجات فوق الصوتية. يؤدي التعرض لضوء الليزر أو الموجات فوق الصوتية إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة البورفيرين وموت الخلايا اللاحق 4,5. في التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) ، يستخدم مضان البورفيرين لتمييز الخلايا السرطانية عن الخلايا الطبيعية6. في هذا السياق ، يستخدم البروتوبورفيرين التاسع ، وهو بورفيرين فلوري طبيعي يتراكم في الأورام عند الحقن الجهازي أو المحلي لسلائفه ، حمض 5-aminolevulinic (5-ALA) ، لتحديد أورام انسجة الجهاز الهضمي وسرطان المثانة وسرطان الدماغ 7,8. في الآونة الأخيرة ، تم استكشاف علاج 5-ALA كنهج للكشف عن الحد الأدنى من المرض المتبقي في المايلوماالمتعددة 9. يستخدم مختبرنا رباعي البورفيرين TCPP (5،10،15،20-tetrakis- (4-carboxyphenyl) -21،23 H-porphine) لقدرته على تلطيخ خلايا سرطان الرئة والخلايا المرتبطة بالسرطان بشكل انتقائي في عينات البلغم البشري ، وهي خاصية تم استغلالها في المقايسات التشخيصية الخلوية القائمة على الشرائحوالتدفق 10.

بعض البورفيرينات ثنائية الوظيفة حيث يمكن استخدامها كعوامل علاجية وتشخيصية 2,11. في البحوث الطبية الحيوية ، تستخدم هذه البورفيرينات ثنائية الوظيفة لتقييم كيف أن قدرتها على استهداف الخلايا السرطانية وقتلها بشكل انتقائي هي دالة على هيكلها وكذلك كيفية تأثرها بوجود مركبات أخرى12،13،14،15،16. يمكن قياس كل من الامتصاص الخلوي للبورفيرينات وسميتها الخلوية على منصة قياس التدفق الخلوي بطريقة عالية الإنتاجية. أطياف الامتصاص والانبعاث للبورفيرينات الفلورية معقدة ، ولكن معظم منصات قياس التدفق الخلوي مجهزة لتحديدها بشكل صحيح. يتميز طيف امتصاص البورفيرينات الفلورية بنطاق امتصاص قوي في نطاق 380-500 نانومتر ، والمعروف باسم نطاق سوريت. يتم ملاحظة نطاقين إلى أربعة نطاقات امتصاص أضعف بشكل عام في نطاق 500-750 نانومتر (نطاقات Q)17. يمكن لليزر الأزرق 488 نانومتر ، الموجود في معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي ، أو الليزر البنفسجي (405 نانومتر) أن يولد ضوءا بالطول الموجي المناسب لإثارة البورفيرينات. عادة ما تعرض أطياف انبعاث البورفيرينات قمم في نطاق 600-800 نانومتر18 ، مما يؤدي إلى تداخل طيفي ضئيل للغاية مع فلوريسئين إيزوثيوسيانات أو فيكوريثرين (PE) ولكن تداخل كبير مع الفلوروفورات الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان ، مثل allophycocyanin (APC) ، وكذلك الفلوروفورات الترادفية ، مثل PE-Cy5 وغيرها. لذلك ، عند استخدام البورفيرينات في مقايسات قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، فإن ضوابط الفلوروفور المفردة ضرورية لتصحيح انتشار التألق بشكل كاف في قنوات أخرى غير تلك المخصصة لقياس مضان البورفيرين.

من الناحية المثالية ، يجب أن تتكون أدوات التحكم أحادية الفلوروفور المستخدمة لحساب مصفوفة الامتداد للوحة من الفلوروفورات (وتسمى أيضا "ضوابط التعويض") من نفس نوع (أنواع) الخلايا مثل العينة. ومع ذلك ، فإن استخدام العينة لهذا الغرض ليس هو الأمثل إذا كان هناك القليل جدا من العينة للبدء بها أو إذا كان السكان المستهدفون داخل العينة صغيرا جدا (على سبيل المثال ، إذا أراد المرء أن ينظر إلى الحد الأدنى المتبقي من المرض أو الخلايا السرطانية في المراحل المبكرة من المرض). بديل مفيد للخلايا هو الخرز المقترن بنفس الفلوروفور المستخدم لتحليل العينة. العديد من هذه الخرز متاحة تجاريا. هذه الحبيبات إما موسومة مسبقا بالفلوروفور المطلوب (حبات خاصة بالفلوروفور المسمى مسبقا)19,20 ، أو يمكن إرفاق جسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت بها (حبات التقاط الأجسام المضادة)20,21. في حين أن حبات التعويض التجارية متاحة للعديد من الفلوروفورات ، فإن هذه الخرزات غير متوفرة للبورفيرينات ، على الرغم من استخدامها المتزايد في البحوث الأساسية والسريرية.

بالإضافة إلى الحفاظ على العينة والمجموعات السكانية الإيجابية مقابل السلبية ذات الحجم المناسب ، فإن المزايا الأخرى لاستخدام الخرز كضوابط تعويض هي سهولة التحضير ، ومضان الخلفية المنخفض ، والاستقرار الممتاز بمرور الوقت22. العيب المحتمل لاستخدام الخرز كعنصر تحكم في التعويض هو أن طيف انبعاث الجسم المضاد الفلوري الذي تم التقاطه على الخرز قد يختلف عن نفس الجسم المضاد المستخدم لتسمية الخلايا. قد يكون هذا ذا أهمية خاصة عند استخدام مقياس التدفق الخلويالطيفي 20. لذلك ، يجب إجراء تطوير الخرز كعنصر تحكم في التعويض على مقياس التدفق الخلوي الذي سيتم استخدامه للفحص الذي تم تطوير الخرز من أجله. علاوة على ذلك ، يجب أن يتضمن تطوير الخرز مقارنة مع الخلايا الموسومة بنفس كاشف تلطيخ الفلورسنت.

هنا ، نصف تحضير حبات تعويض البوليسترين التي تعمل بالأمين TCPP ، والتي كان متوسط شدة مضانها في قناة الكشف مشابها لتلك الموجودة في الخلايا التي تحمل علامة TCPP في البلغم ، واستخدامها كضوابط تعويض لقياس التدفق الخلوي. كان التألق الذاتي للخرز المكافئ غير الوظيفي منخفضا بما يكفي لاستخدامها كضوابط تعويض مضان سلبية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت هذه الخرز الاستقرار في التخزين لما يقرب من 1 سنة.

Protocol

يجب القيام بجميع الإجراءات باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. تحضير محلول مخزون TCPP ، 1.0 مجم / مل

ملاحظة: يمكن إعداد هذا شهريا.

  1. باستخدام ميزان تحليلي وملعقة وورق وزن ، تزن 49.0-50.9 مجم من TCPP. تقريب الوزن إلى 1/10 ملليغرام. اضبط الكمية المقاسة من TCPP جانبا محمية من الضوء.
    ملاحظة: استخدم مسدسا ثابتا إذا كانت قراءة الوزن غير مستقرة.
  2. حدد الكميات المطلوبة من الماء النقي والأيزوبروبانول (IPA) من الجدول 1 بناء على كمية TCPP التي تم وزنها في الخطوة 1.1. أضف الماء النقي والأيزوبروبانول إلى دورق زجاجي سعة 100 مل ، وقم بتغطيته ببارافيلم للحماية من التبخر.
  3. حدد الكمية المطلوبة من بيكربونات الصوديوم من الجدول 1 بناء على كمية TCPP التي تم وزنها في الخطوة 1.1 .
  4. باستخدام الميزان التحليلي والملعقة وورق الوزن، قم بوزن الكمية المطلوبة من بيكربونات الصوديوم المحددة في الخطوة 1.3. تقريب الوزن إلى 1/10 ملليغرام.
    ملاحظة: استخدم مسدسا ثابتا إذا كانت قراءة الوزن غير مستقرة.
  5. أضف بيكربونات الصوديوم إلى الدورق سعة 100 مل الذي يحتوي على ماء نقي وأيزوبروبانول. قم بتغطية المحلول بالأغشية الرقيقة للحماية من التبخر.
  6. ضع المحلول من الخطوة 1.5 على طبق تقليب ، وحركه حتى يذوب (حوالي 10 دقائق)
  7. قم بقياس الأس الهيدروجيني للتأكد من أن المحلول المحتوي على بيكربونات الصوديوم من الخطوة 1.6 له أس هيدروجيني بين 9 و10.
  8. أضف وزن TCPP ببطء في الخطوة 1.1 إلى المحلول من الخطوة 1.7 ، واستمر في التقليب حتى يذوب (~ 30 دقيقة). يحفظ بعيدا عن الضوء أثناء هذه الخطوة.
  9. تخزينها في وعاء زجاجي أو البولي بروبلين في درجة حرارة الغرفة ومحمية من الضوء.

2. تحضير 2- (N -morpholino) - حمض إيثان سلفونيك (MES) ومحلول عازلة ملح الصوديوم ، 0.1 M ، درجة الحموضة 6.0-6.2 ("MES buffer")

ملاحظة: يجب تحضير هذا في يوم الاستخدام وحفظه في درجة حرارة الغرفة.

  1. قم بوزن 2.50 جم من ملح الصوديوم MES ، وأضفه إلى زجاجة بلاستيكية سعة 150 مل.
  2. أضف 121 مل من الماء النقي ، وقم بإذابته عن طريق الرج اليدوي حتى لا تظهر مادة صلبة.
  3. قم بقياس الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت MES للتأكد من أنه بين 6 و 6.2.
  4. يحفظ في درجة حرارة الغرفة للاستخدام في نفس اليوم.

3. N- (3-ديميثليامينوبروبيل) -N'-إيثيل كاربوديميد (EDC) مسحوق

  1. أخرج مسحوق EDC من الفريزر ، واتركه في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامه في الخطوة 5.

4. الجمع بين حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين مع محلول TCPP

  1. أضف 4.3 مل من محلول المخزن المؤقت 0.1 M MES المحضر في الخطوة 2 إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
  2. دوامة تعليق حبة البوليسترين الوظيفية بالأمين (10 ميكرومتر ، 2.5٪ وزن / حجم) لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة.
  3. أضف 288 ميكرولتر من تعليق حبة الدوامة حديثا إلى المخزن المؤقت MES من الخطوة 4.1.
  4. دوامة حل MES / حبة لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة.
  5. دوامة محلول TCPP 1 مجم / مل محضر في الخطوة 1 لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة.
  6. أضف 1.20 مل من حل مخزون TCPP الدوامي حديثا إلى تعليق MES / حبة من الخطوة 4.4.
  7. دوامة تعليق MES / حبة / TCPP لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة.
  8. قم بتغطية الأنبوب بورق القصدير أثناء تحضير محلول EDC.

5. تحضير محلول مخزون هيدروكولوريد (HCl) N- (3-ديميثليامينوبروبيل) -N'-إيثيل كاربوديميد (EDC)

ملاحظة: محلول EDC قابل للتلف ويجب استخدامه مباشرة بعد التحضير.

  1. أضف 20.0 مل من الماء النقي إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  2. قم بوزن 200 مجم من EDC HCl من الخطوة 3 ، وأضفه إلى الماء (الخطوة 5.1).
  3. دوامة EDC HCL لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة لتوليد حل واضح.

6. إعداد حل عمل EDC HCl / MES

ملاحظة: محلول EDC HCl / MES قابل للتلف ويجب استخدامه مباشرة بعد التحضير.

  1. أضف 54.0 مل من محلول MES العازل (المحضر في الخطوة 2) إلى زجاجة بلاستيكية سعة 150 مل.
  2. أضف 6.0 مل من محلول مخزون EDC HCl (المحضر في الخطوة 5) إلى محلول المخزن المؤقت MES ، واخلطه بالرج لمدة 10 ثوان.

7. وضع العلامات على الخرز باستخدام TCPP

  1. أضف 4.5 مل من محلول عمل EDC (من الخطوة 6) إلى أنبوب البولي بروبلين سعة 15 مل الذي يحتوي على الخرزات و TCPP في المخزن المؤقت MES (الخطوة 4.7).
  2. ضع الأنبوب في دوار مقلوب عند 35 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة ومحمي من الضوء.
  3. جهاز طرد مركزي الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم.
  4. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الخرزات في 0.8 مل من محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS).
  5. انقل محلول الخرزة إلى قارورة من مادة البولي بروبيلين الكهرمانية باستخدام ماصة سعة 1 مل ، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: الخرزات مستقرة لمدة 3 أشهر على الأقل في هذه المرحلة.

8. فحص الجودة (QC) لخرز TCPP عن طريق قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يجب أن تركز مراقبة الجودة على ما إذا كان متوسط شدة التألق (MFI) لخرز TCPP ساطعا بدرجة كافية للاستخدام المقصود وكمية الجسيمات الناتجة عن الإجراء. راجع قسم النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل.

  1. قم بتسمية أنبوب بوليسترين واحد سعة 5 مل باسم "حبات TCPP السالبة".
    ملاحظة: تختلف الخرزات السالبة عن الحبيبات الوظيفية للأمين المستخدمة في وضع العلامات. انظر جدول المواد.
  2. قم بتسمية أنبوب آخر باسم "حبات TCPP الإيجابية".
  3. قم بتسمية أنبوب آخر باسم "حبات قوس قزح".
  4. القسمة 300 ميكرولتر من HBSS المثلج البارد في الأنابيب الموسومة ب "حبات TCPP السالبة" و "حبات TCPP الإيجابية".
  5. أضف 500 ميكرولتر من HBSS المثلج البارد إلى الأنبوب المسمى "حبات قوس قزح".
  6. دوامة تعليق حبة البوليسترين غير الوظيفية (غير المصنفة) لفترة وجيزة بأقصى سرعة (2-3 ثوان) ، وأضف 10 ميكرولتر منه إلى الأنبوب المسمى "حبات TCPP السالبة".
  7. دوامة تعليق حبة TCPP المسمى (تم الانتهاء منه في الخطوة 7.5) لفترة وجيزة بأقصى سرعة ، وأضف 3 ميكرولتر منه إلى أنبوب "حبيبات TCPP الإيجابية".
  8. دوامة تعليق حبة قوس قزح لفترة وجيزة بأقصى سرعة ، وإضافة قطرتين منه في أنبوب "حبات قوس قزح".
  9. احتفظ بجميع الأنابيب على الثلج ومغطاة ومحمية من الضوء.
  10. بدء إجراءات بدء التشغيل اليومية المناسبة لمقياس التدفق الخلوي ، وإجراء مراقبة الجودة للتحقق من السوائل المثلى ومحاذاة الليزر.
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، يفترض أن المشغل مدرب على استخدام مقياس التدفق الخلوي المتاح ، بما في ذلك إجراءات توحيد تشتت الضوء وشدة التألق ، وكذلك المبادئ الأساسية لحساب مصفوفة التعويض الصحيحة.
  11. قم بتشغيل حبات قوس قزح وخرز TCPP دون تغيير إعدادات الجهد بين عمليات التشغيل المختلفة.
    1. قم بتشغيل وجمع 10000 حدث من حبات قوس قزح.
    2. قم بإجراء شطف بالماء ، واجمع 10000 حدث من حبات TCPP السلبية.
    3. قم بإجراء شطف بالماء ، واجمع 10000 حدث من حبات TCPP الإيجابية.
    4. قم بإجراء شطف بالماء لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: من المهم إجراء شطف بالماء بعد تشغيل حبات TCPP. إذا لم يتم شطف TCPP من الخطوط الموجودة في مقياس الخلايا ، فهناك احتمال أن يتمكن TCPP المتبقي من تسمية الخلايا في الأنبوب التالي المراد الحصول عليه.
    5. قم بتنفيذ بروتوكولات التنظيف والإغلاق المناسبة الخاصة بتعليمات الشركة المصنعة لمقياس الخلايا.
      ملاحظة: للاطلاع على النتائج التمثيلية، انظر الشكل 1.

9. ترشيح حبة

ملاحظة: إذا أظهرت مراقبة الجودة للخرزات عن طريق قياس التدفق الخلوي (الخطوة 8) نسبة عالية من الجسيمات (70٪ أو أعلى) ، ففكر في ترشيح تعليق الخرزة باستخدام البروتوكول أدناه (الشكل 2).

  1. أضف 3.20 مل من HBSS المثلج البارد إلى 0.8 مل من تعليق حبة TCPP الذي تم الانتهاء منه في الخطوة 7.5 (إنشاء تخفيف خمسة أضعاف).
  2. دوامة تعليق حبة مخففة بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية.
  3. أخرج المكبس من حقنة سعة 5 مل يمكن التخلص منها.
  4. قم بتركيب المحقنة بفلتر طرف من الألياف الزجاجية (5 ميكرومتر ، قطر 13 مم).
  5. أضف 4 مل من HBSS إلى المحقنة.
  6. أضف 0.5 مل من معلق الخرزة المخففة الدوامة (الخطوة 9.2).
  7. استخدم المكبس لتصفية التعليق من خلال إعداد المحقنة / المرشح عند حوالي 2 قطرة / ثانية.
  8. اغسل الخرزات عن طريق سحب 5 مل من HBSS الطازج في المحقنة من خلال الفلتر عند حوالي 2 قطرة / ثانية.
  9. ادفع HBSS للخارج مرة أخرى في حاوية النفايات بمعدل 2 قطرة / ثانية تقريبا.
  10. لإزالة الخرزات من الفلتر ، ارسم 5 مل أخرى من HBSS الطازج في المحقنة من خلال الفلتر.
  11. قم بإزالة المرشح بعناية من المحقنة.
  12. أخرج تعليق الخرزة من المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
  13. ضع الفلتر مرة أخرى على المحقنة ، وكرر الخطوات 9.10-9.12 أربع مرات أخرى. ثم تخلص من الفلتر والمحقنة.
  14. كرر الخطوات 9.2-9.13 حتى تتم تصفية جميع الخرزات من الخطوة 9.1. استخدم حقنة جديدة وقم بالتصفية في كل مرة.
  15. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخرزة المفلترة لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  16. قم بنضح المادة الطافية لكل أنبوب سعة 50 مل ، وأعد تعليق الخرزات برفق ، وادمجها في 0.5 مل من HBSS الطازج.
  17. انقل الخرزات باستخدام ماصة دقيقة p1,000 إلى قنينة كهرمانية أو زجاجية أو بولي بروبيلين جديدة ، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  18. كرر الخطوة 8 لتحديد ما إذا كانت نسبة الجسيمات المرتبطة ب TCPP في تعليق الخرزة المفلترة قد انخفضت. للاطلاع على النتائج التمثيلية، انظر الشكل 3.

النتائج

هذا البروتوكول لوضع العلامات TCPP للخرز سريع وفعال نسبيا. يوضح الشكل 1 نتيجة تمثيلية لعملية وضع العلامات على حبيبات TCPP كما هو محدد بواسطة قياس التدفق الخلوي. يوضح الشكل 1 أ المظهر الجانبي القياسي لخرز قوس قزح ، كما تم اكتشافه في القناة المناسبة للكشف عن TCPP. تعم...

Discussion

على الرغم من التطبيقات العديدة للبورفيرينات في تشخيص السرطان وعلاجاته2 ، إلا أن هناك أدبيات محدودة حول استخدامها المحتمل ككاشف لقياس التدفق الخلوي لتحديد مجموعات الخلايا السرطانية مقابل غير السرطانية في الأنسجة البشرية الأولية24،25،

Disclosures

جميع المؤلفين هم موظفون في تقنيات التقارب الحيوي.

Acknowledgements

نود أن نشكر ديفيد رودريغيز على المساعدة في إعداد الشكل وخدمات علم الأمراض الدقيقة (سان أنطونيو ، تكساس) لاستخدام مقياس التدفق الخلوي Navios EX.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. . US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
  26. . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. . US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved