Perlas modificadas con porfirina para uso como controles de compensación en citometría de flujo

Resumen

El protocolo describe cómo se preparan las perlas de compensación basadas en porfirina para la citometría de flujo mediante la reacción de perlas de poliestireno funcionalizadas con amina con la porfirina TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC. Se utiliza un procedimiento de filtración para reducir los subproductos de partículas.

Resumen

La citometría de flujo puede caracterizar y cuantificar rápidamente diversas poblaciones celulares basadas en mediciones de fluorescencia. Las células se tiñen primero con uno o más reactivos fluorescentes, cada uno funcionalizado con una molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se une a las células selectivamente en función de sus características fenotípicas, como la expresión de antígenos de superficie celular. La intensidad de la fluorescencia de cada reactivo unido a las células se puede medir en el citómetro de flujo utilizando canales que detectan un rango específico de longitudes de onda. Cuando se utilizan múltiples fluoróforos, la luz de fluoróforos individuales a menudo se derrama en canales de detección no deseados, lo que requiere una corrección de los datos de intensidad de fluorescencia en un proceso llamado compensación.

Las partículas de control de compensación, típicamente perlas de polímero unidas a un solo fluoróforo, son necesarias para cada fluoróforo utilizado en un experimento de etiquetado celular. Los datos de las partículas de compensación del citómetro de flujo se utilizan para aplicar una corrección a las mediciones de intensidad de fluorescencia. Este protocolo describe la preparación y purificación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas covalentemente con el reactivo fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) y su aplicación en compensación por citometría de flujo. En este trabajo, las perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas se trataron con TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) a pH 6 y a temperatura ambiente durante 16 h con agitación. Las perlas TCPP se aislaron por centrifugación y se resuspendieron en un tampón de pH 7 para su almacenamiento. Las partículas relacionadas con TCPP se observaron como un subproducto. El número de estas partículas podría reducirse utilizando un protocolo de filtración opcional. Las perlas TCPP resultantes se utilizaron con éxito en un citómetro de flujo para la compensación en experimentos con células de esputo humano marcadas con múltiples fluoróforos. Las perlas TCPP demostraron ser estables después del almacenamiento en un refrigerador durante 300 días.

Introducción

Las porfirinas han sido de interés durante muchos años en el campo biomédico debido a sus propiedades fluorescentes y dirigidas a tumores ^1,2,3. Las aplicaciones terapéuticas como la terapia fotodinámica (TFD) y la terapia sonodinámica (SDT) implican la administración sistémica de una porfirina a un paciente con cáncer, la acumulación del fármaco en el tumor y la exposición localizada del tumor a una luz láser de una longitud de onda específica o ultrasonido. La exposición a la luz láser o ultrasonido conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno por la porfirina y....

Protocolo

Todos los procedimientos deben realizarse utilizando el equipo de protección personal adecuado.

1. Preparación de la solución madre TCPP, 1,0 mg/ml

NOTA: Esto se puede preparar mensualmente.

1. Usando una balanza analítica, espátula y papel de pesaje, pesa 49.0-50.9 mg de TCPP. Redondee el peso a 1/10 de miligramo. Establezca la cantidad medida de TCPP protegida de la luz.
   NOTA: Use una pistola estática si la lectura de peso es inestable.
2. Determine las cantidades requeridas de agua purificada e isopropanol (IPA) de la Tabla 1 en función de la cantidad de TCPP pesada en el paso....

Discusión

A pesar de las muchas aplicaciones de las porfirinas en el diagnóstico y la terapéutica del cáncer², existe una literatura limitada sobre su uso potencial como reactivo citométrico de flujo para la identificación de poblaciones celulares cancerosas versus no cancerosas en tejidos humanos primarios^24,25,26. Nuestra investigación sobre el análisis citométrico de flujo del esputo humano

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365