卟啉修饰微球用作流式细胞术补偿质控

摘要

该方案描述了如何通过胺官能化聚苯乙烯珠与卟啉TCPP和酰胺偶联试剂EDC的反应来制备用于流式细胞术的基于卟啉的补偿珠。过滤程序用于减少颗粒副产物。

摘要

流式细胞术可以根据荧光测量快速表征和定量不同的细胞群。首先用一种或多种荧光试剂对细胞进行染色，每种试剂都用不同的荧光分子（荧光团）进行功能化，荧光团根据其表型特征（例如细胞表面抗原表达）选择性地与细胞结合。与细胞结合的每种试剂的荧光强度可以在流式细胞仪上使用检测指定波长范围的通道进行测量。当使用多个荧光团时，来自单个荧光团的光通常会溢出到不需要的检测通道中，这需要在称为补偿的过程中对荧光强度数据进行校正。

细胞标记实验中使用的每个荧光团都需要补偿对照颗粒，通常是与单个荧光团结合的聚合物微球。来自流式细胞仪补偿颗粒的数据用于对荧光强度测量进行校正。该协议描述了与荧光试剂内消旋-四（4-羧基苯基）卟啉（TCPP）共价官能化的聚苯乙烯补偿珠的制备和纯化及其在流式细胞术补偿中的应用。在这项工作中，用TCPP和酰胺偶联试剂EDC（N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐）在pH 6和室温下搅拌16 h处理胺官能化的聚苯乙烯珠。通过离心分离TCPP磁珠，并重悬于pH 7缓冲液中储存。与TCPP相关的颗粒物被观察到为副产品。这些颗粒的数量可以使用可选的过滤方案来减少。所得TCPP磁珠成功用于流式细胞仪，用于用多个荧光团标记的人痰细胞实验中的补偿。TCPP珠子在冰箱中储存300天后被证明是稳定的。

引言

卟啉因其荧光和肿瘤靶^{向特性而在}生物医学领域引起了多年的关注1，^2，3。光动力疗法（PDT）和声动力疗法（SDT）等治疗应用需要向癌症患者全身施用卟啉，药物在肿瘤中的积累以及肿瘤局部暴露于特定波长的激光或超声波。暴露于激光或超声波会导致卟啉产生活性氧，随后细胞死亡^4，5。在光动力诊断（PDD）中，卟啉荧光用于区分癌细胞和正常细胞⁶。在这种情况下，原卟啉 IX 是一种天然荧光卟啉，在全身或局部注射其前体 5-氨基乙酰丙酸 （5-ALA） 后积聚在肿瘤中，用于识别胃肠道间质瘤、膀胱癌和脑癌^7，8。最近，探索了5-ALA治疗作为检测多发性^骨髓瘤9中微小残留病的方法。我们的实验室一直在使用四芳基卟啉TCPP（5，10，15，20-四-（4-羧基苯基）-21，23H-卟啉），因为它能够选择性地染色人痰样本中的肺癌细胞和癌症相关细胞，这一特性已在基于玻片和流式细胞术诊断测定中得到利用

研究方案

所有程序都需要使用适当的个人防护设备来完成。

1. TCPP储备溶液的制备，1.0 mg/ mL

注意：这可以每月准备一次。

1. 使用分析天平、刮刀和称量纸，称取 49.0-50.9 mg TCPP。将重量四舍五入为 1/10 毫克。将测量的TCPP量放在避光的地方。
   注意：如果重量读数不稳定，请使用静态喷枪。
2. 根据步骤1.1中称量的TCPP量，从 表1 中确定所需的纯化水和异丙醇（IPA）的量。将纯净水和异丙醇加入 100 mL 玻璃烧杯中，并覆盖封口膜以防止蒸发。
3. 根据步骤1.1中称量的TCPP量，确定 表1 中碳酸氢钠的所需量。
4. 使用分析天平、刮刀和称量纸，称取步骤1.3中测定的所需碳酸氢钠量。将重量四舍五入为 1/10 毫克。
   注意：如果重量读数不稳定，请使用静态喷枪。
5. 将碳酸氢钠加入装有纯净水和异丙醇的 100 mL 烧杯中。用封口膜覆盖溶液以防止蒸发。
6. 将步骤1.5中的溶液放在搅拌板上，搅拌直至溶解（约10分钟）
7. 测量pH以确保步骤1.6中的含碳酸氢钠溶液的pH值在9和10之间。
8. 将步骤1.1中称量的TCPP缓慢加入步骤1.7的溶液中，并继续搅....

讨论

尽管卟啉在癌症诊断和治疗学中有许多^应用2，但关于它们作为流式细胞术试剂用于鉴定原代人体组织中癌性与非癌性细胞群的潜在用途的文献有限^24，25，26。我们对人痰^24，27 的流式细胞术分析的研究需要用TCPP和其他几种荧光团对解离的痰细胞进行染色。然而，TCP.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365