Perle modificate con porfirina da utilizzare come controllo di compensazione nella citometria a flusso

Riepilogo

Il protocollo descrive come le sfere di compensazione a base di porfirina per la citometria a flusso vengono preparate dalla reazione di perle di polistirene funzionalizzato con la porfirina TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC. Una procedura di filtrazione viene utilizzata per ridurre i sottoprodotti del particolato.

Abstract

La citometria a flusso può rapidamente caratterizzare e quantificare diverse popolazioni cellulari sulla base di misurazioni di fluorescenza. Le cellule vengono prima colorate con uno o più reagenti fluorescenti, ciascuno funzionalizzato con una diversa molecola fluorescente (fluoroforo) che si lega alle cellule selettivamente in base alle loro caratteristiche fenotipiche, come l'espressione dell'antigene della superficie cellulare. L'intensità della fluorescenza da ciascun reagente legato alle cellule può essere misurata sul citometro a flusso utilizzando canali che rilevano una gamma specifica di lunghezze d'onda. Quando vengono utilizzati più fluorofori, la luce dei singoli fluorofori spesso si riversa in canali di rilevamento indesiderati, il che richiede una correzione dei dati di intensità della fluorescenza in un processo chiamato compensazione.

Le particelle di controllo della compensazione, tipicamente perle polimeriche legate a un singolo fluoroforo, sono necessarie per ogni fluoroforo utilizzato in un esperimento di etichettatura cellulare. I dati delle particelle di compensazione del citometro a flusso vengono utilizzati per applicare una correzione alle misurazioni dell'intensità di fluorescenza. Questo protocollo descrive la preparazione e la purificazione di perle di compensazione del polistirene funzionanti covalentemente con il reagente fluorescente meso-tetra(4-carbossifenil) porfina (TCPP) e la loro applicazione nella compensazione della citometria a flusso. In questo lavoro, le perle di polistirene funzionalizzate con ammina sono state trattate con TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC (N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato) a pH 6 e a temperatura ambiente per 16 ore con agitazione. Le perle TCPP sono state isolate mediante centrifugazione e risospese in un tampone pH 7 per lo stoccaggio. Il particolato correlato al TCPP è stato osservato come sottoprodotto. Il numero di questi particolati potrebbe essere ridotto utilizzando un protocollo di filtrazione opzionale. Le perle TCPP risultanti sono state utilizzate con successo su un citometro a flusso per la compensazione in esperimenti con cellule di espettorato umano etichettate con più fluorofori. Le perle TCPP si sono dimostrate stabili dopo la conservazione in frigorifero per 300 giorni.

Introduzione

Le porfirine sono di interesse da molti anni in campo biomedico grazie alla loro fluorescenza e alle proprietà tumorali ^1,2,3. Le applicazioni terapeutiche come la terapia fotodinamica (PDT) e la terapia sonodinamica (SDT) comportano la somministrazione sistemica di una porfirina a un paziente oncologico, l'accumulo del farmaco nel tumore e l'esposizione localizzata del tumore a una luce laser di una specifica lunghezza d'onda o ultrasuoni. L'esposizione alla luce laser o agli ultrasuoni porta alla generazione di specie reattive dell'ossigeno da parte della porfirina e alla successiva morte cellulare ^4,5. Nella diagnosi fotodinamica (PDD), la fluorescenza della porfirina viene utilizzata per distinguere le cellule tumorali dalle cellule normali⁶. In questo contesto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente naturale che si accumula nei tumori dopo l'iniezione sistemica o locale del suo precursore, l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA), viene utilizzata per identificare i tumori stromali gastrointestinali, il cancro della vescica e il cancro al cervello ^7,8. Più recentemente, il trattamento con 5-ALA è stato esplorato come approccio per rilevare la malattia residua minima nel mieloma multiplo⁹. Il nostro laboratorio ha utilizzato la porfirina tetraarilica TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carbossifenil)-21,23 H-porfina) per la sua capacità di colorare selettivamente le cellule tumorali polmonari e le cellule associate al cancro in campioni di espettorato umano, che è una proprietà che è stata sfruttata in saggi diagnostici citometrici basati su vetrini e a flusso¹⁰.

Alcune porfirine sono bifunzionali in quanto possono essere utilizzate come agenti terapeutici e diagnostici ^2,11. Nella ricerca biomedica, tali porfirine bifunzionali sono utilizzate per valutare come la loro capacità di colpire selettivamente e uccidere le cellule tumorali sia una funzione della loro struttura e come sia influenzata dalla presenza di altri composti 12,13,14,15,16. Sia l'assorbimento cellulare delle porfirine che la loro citotossicità possono essere misurati su una piattaforma citometrica a flusso in modo ad alto rendimento. Gli spettri di assorbimento ed emissione delle porfirine fluorescenti sono complessi, ma la maggior parte delle piattaforme citometriche a flusso sono attrezzate per identificarle correttamente. Lo spettro di assorbimento delle porfirine fluorescenti è caratterizzato da una forte banda di assorbimento nell'intervallo 380-500 nm, nota come banda Soret. Da due a quattro bande di assorbimento più deboli sono generalmente osservate nell'intervallo 500-750 nm (bande Q)¹⁷. Un laser blu da 488 nm, presente nella maggior parte dei citometri a flusso, o un laser viola (405 nm) possono generare luce della lunghezza d'onda appropriata per eccitare le porfirine. Gli spettri di emissione delle porfirine mostrano tipicamente picchi nell'intervallo 600-800 nm¹⁸, il che si traduce in una sovrapposizione spettrale molto piccola con i fluorofori di isotiocianato di fluoresceina o ficoeritrina (PE), ma una notevole sovrapposizione con altri fluorofori spesso usati, come l'alloficocianina (APC), così come i fluorofori tandem, come PE-Cy5 e altri. Pertanto, quando si utilizzano le porfirine in saggi di citometria a flusso multicolore, i controlli a singolo fluoroforo sono essenziali per correggere adeguatamente lo spillover della fluorescenza in canali diversi da quello designato per misurare la fluorescenza della porfirina.

Idealmente, i controlli a singolo fluoroforo utilizzati per calcolare la matrice di spillover per un pannello di fluorofori (chiamati anche "controlli di compensazione") dovrebbero essere costituiti dallo stesso tipo di cella del campione. Tuttavia, l'utilizzo del campione per questo scopo non è ottimale se c'è pochissimo campione per iniziare o se la popolazione target all'interno del campione è molto piccola (ad esempio, se si vuole guardare alla malattia residua minima o alle cellule tumorali nelle prime fasi della malattia). Un'alternativa utile alle cellule sono le perle accoppiate con lo stesso fluoroforo che viene utilizzato per analizzare il campione. Molte di queste perle sono disponibili in commercio; Queste perle sono premarcate con il fluoroforo desiderato (perle premarcate specifiche per fluorofori)^19,20, oppure un anticorpo marcato con fluorescenza può essere attaccato ad esse (perle di cattura degli anticorpi)^20,21. Mentre le perle di compensazione commerciali sono disponibili per molti fluorofori, tali perle non sono disponibili per le porfirine, nonostante il loro crescente uso nella ricerca di base e clinica.

Oltre alla conservazione del campione e alle popolazioni positive rispetto a quelle negative opportunamente dimensionate, gli altri vantaggi dell'uso delle perle come controlli di compensazione sono la facilità di preparazione, la bassa fluorescenza di fondo e l'eccellente stabilità nel tempo²². Il potenziale svantaggio dell'uso delle perle come controllo di compensazione è che lo spettro di emissione dell'anticorpo fluorescente catturato sulle perle può differire da quello dello stesso anticorpo utilizzato per etichettare le cellule. Questo può essere di particolare importanza quando si utilizza un citometro a flusso spettrale²⁰. Pertanto, lo sviluppo di perle come controllo di compensazione deve essere eseguito sul citometro a flusso che verrà utilizzato per il test per il quale vengono sviluppate le perle. Inoltre, lo sviluppo delle perle deve includere un confronto con le cellule etichettate con lo stesso reagente colorante fluorescente.

Qui, descriviamo la preparazione di perle di compensazione in polistirene funzionalizzato con ammina TCPP, la cui intensità mediana di fluorescenza nel canale di rilevamento era paragonabile a quella delle cellule marcate con TCPP nell'espettorato e il loro uso come controlli di compensazione per la citometria a flusso. L'autofluorescenza di sfere equivalenti e non funzionalizzate era sufficientemente bassa per il loro uso come controlli di compensazione della fluorescenza negativa. Inoltre, queste perle hanno dimostrato stabilità nello stoccaggio per quasi 1 anno.

Protocollo

Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati.

1. Preparazione della soluzione madre TCPP, 1,0 mg / ml

NOTA: Questo può essere preparato mensilmente.

1. Utilizzando una bilancia analitica, una spatola e una carta da pesata, pesare 49,0-50,9 mg di TCPP. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo. Mettere da parte la quantità misurata di TCPP al riparo dalla luce.
   NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile.
2. Determinare le quantità richieste di acqua purificata e isopropanolo (IPA) dalla Tabella 1 in base alla quantità di TCPP pesata nel passaggio 1.1 . Aggiungere l'acqua purificata e l'isopropanolo in un becher di vetro da 100 ml e coprire con parafilm per proteggere dall'evaporazione.
3. Determinare la quantità richiesta di bicarbonato di sodio dalla Tabella 1 in base alla quantità di TCPP pesata nel passaggio 1.1 .
4. Utilizzando la bilancia analitica, la spatola e la carta da lavoro, pesare la quantità necessaria di bicarbonato di sodio determinata al punto 1.3. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo.
   NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile.
5. Aggiungere il bicarbonato di sodio al becher da 100 mL contenente acqua purificata e isopropanolo. Coprire la soluzione con parafilm per proteggere dall'evaporazione.
6. Porre la soluzione dal punto 1.5 su una piastra di agitazione e mescolare fino a quando non si scioglie (circa 10 min)
7. Misurare il pH per assicurarsi che la soluzione contenente bicarbonato di sodio del punto 1.6 abbia un pH compreso tra 9 e 10.
8. Aggiungere lentamente il TCPP pesato al punto 1.1 alla soluzione dal punto 1.7 e continuare a mescolare fino a quando non si è sciolto (~30 min). Proteggere dalla luce durante questa fase.
9. Conservare in un contenitore di vetro o polipropilene a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.

2. Preparazione di acido 2-(N-morfolino)-etanosolfonico (MES) e soluzione tampone di sali semisodici, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampone MES")

NOTA: Questo deve essere preparato il giorno dell'uso e conservato a temperatura ambiente.

1. Pesare 2,50 g di sale semisodico MES e aggiungerlo a un flacone di plastica da 150 ml.
2. Aggiungere 121 ml di acqua purificata e sciogliere agitando manualmente fino a quando non è visibile alcun solido.
3. Misurare il pH del tampone MES per assicurarsi che sia compreso tra 6 e 6,2.
4. Mantenere a temperatura ambiente per l'uso nello stesso giorno.

3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-etilcarbodiimmide (EDC) polvere

1. Estrarre la polvere EDC dal congelatore e lasciarla riposare a temperatura ambiente fino all'uso nella fase 5.

4. Combinazione di perle di polistirene funzionalizzate con ammina con soluzione TCPP

1. Aggiungere 4,3 mL della soluzione tampone MES da 0,1 M preparata nella fase 2 in un tubo di polipropilene da 15 ml.
2. Vortex la sospensione di perline di polistirene funzionalizzata all'ammina (10 μm, 2,5% p/v) per 60 s alla massima velocità.
3. Aggiungere 288 μL di questa sospensione di perline appena vortexed al tampone MES dal punto 4.1.
4. Vortex la soluzione MES/bead per 15 s alla massima velocità.
5. Vortex la soluzione TCPP da 1 mg/mL preparata al punto 1 per 60 s alla massima velocità.
6. Aggiungere 1,20 mL di questa soluzione madre TCPP appena vortexed alla sospensione MES/bead dal punto 4.4.
7. Vortex la sospensione MES/bead/TCPP per 15 s alla massima velocità.
8. Coprire il tubo con un foglio mentre la soluzione EDC è preparata.

5. Preparazione della soluzione madre di idrocoloride (HCl) di N-(3-dimetlyaminopropil)-N'-etilcarbodiimmide (EDC)

NOTA: La soluzione EDC è deperibile e deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione.

1. Aggiungere 20,0 ml di acqua purificata in un nuovo tubo conico da 50 ml.
2. Pesare 200 mg di EDC HCl dal punto 3 e aggiungerlo all'acqua (punto 5.1).
3. Vortice l'EDC HCL per 15 s alla massima velocità per generare una soluzione chiara.

6. Preparazione della soluzione di lavoro EDC HCl/MES

NOTA: La soluzione EDC HCl/MES è deperibile e deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione.

1. Aggiungere 54,0 mL di soluzione tampone MES (preparata al punto 2) in un flacone di plastica da 150 ml.
2. Aggiungere 6,0 mL della soluzione madre EDC HCl (preparata al punto 5) alla soluzione tampone MES e mescolare agitando per 10 s.

7. Etichettatura delle perline con TCPP

1. Aggiungere 4,5 mL di soluzione di lavoro EDC (dal punto 6) al tubo di polipropilene da 15 mL contenente le perline e TCPP nel tampone MES (punto 4.7).
2. Posizionare il tubo in un rotatore invertente a 35 giri / min per 16 ore a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
3. Centrifugare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti a 1.000 × g.
4. Aspirare il surnatante e risospendere le perle in 0,8 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS).
5. Trasferire la soluzione di perline in un flaconcino di polipropilene ambrato con una pipetta da 1 mL e conservare a 4 °C fino a ulteriore utilizzo.
   NOTA: Le perle sono stabili per almeno 3 mesi a questo punto.

8. Controllo di qualità (QC) delle sfere TCPP mediante citometria a flusso

NOTA: il QC deve essere centrato sul fatto che l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) delle sfere TCPP sia sufficientemente luminosa per l'uso previsto e la quantità di particolato generato dalla procedura. Per ulteriori dettagli, consulta la sezione dei risultati rappresentativi.

1. Etichettare un tubo di polistirene da 5 ml come "perline negative TCPP".
   NOTA: Le perle negative sono diverse dalle perle funzionalizzate dall'ammina utilizzate per l'etichettatura. Vedere la tabella dei materiali.
2. Etichetta un altro tubo come "perline positive TCPP".
3. Etichetta un altro tubo come "Perline arcobaleno".
4. Aliquot 300 μL di HBSS ghiacciato nei tubi etichettati con "perline negative TCPP" e "perline positive TCPP".
5. Aggiungere 500 μL di HBSS ghiacciato nel tubo etichettato come "perline arcobaleno".
6. Vortice la sospensione del cordone in polistirene non funzionalizzato (non etichettato) brevemente alla massima velocità (2-3 s) e aggiungerne 10 μL al tubo etichettato "perline negative TCPP".
7. Vortice la sospensione del tallone marcata TCPP (finalizzata al punto 7.5) brevemente alla massima velocità e aggiungerne 3 μL al tubo "perline positive TCPP".
8. Vortice la sospensione del tallone arcobaleno brevemente alla massima velocità e aggiungine due gocce nel tubo "Perline arcobaleno".
9. Tenere tutti i tubi sul ghiaccio, coperti e protetti dalla luce.
10. Avviare le procedure di avvio giornaliere appropriate del citometro a flusso ed eseguire un controllo qualità per verificare i fluidi ottimali e l'allineamento laser.
    NOTA: Per questa parte del protocollo, si presume che l'operatore sia addestrato nell'uso del citometro a flusso disponibile, comprese le procedure di standardizzazione della diffusione della luce e dell'intensità della fluorescenza, nonché i principi di base del calcolo della corretta matrice di compensazione.
11. Eseguire le perline arcobaleno e le perline TCPP senza modificare le impostazioni di tensione tra le diverse esecuzioni.
    1. Corri e raccogli 10.000 eventi delle perline arcobaleno.
    2. Eseguire un risciacquo con acqua e raccogliere 10.000 eventi delle perle TCPP-negative.
    3. Eseguire un risciacquo con acqua e raccogliere 10.000 eventi delle perline TCPP-positive.
    4. Eseguire un risciacquo con acqua di 1 minuto.
       NOTA: è importante eseguire un risciacquo con acqua dopo aver eseguito le perline TCPP. Se il TCPP non viene risciacquato dalle linee nel citometro, esiste la possibilità che il TCPP residuo possa etichettare le cellule nella provetta successiva da acquisire.
    5. Eseguire i protocolli di pulizia e spegnimento appropriati specifici per le istruzioni del produttore per il citometro.
       NOTA: per i risultati rappresentativi, vedere la Figura 1.

9. Filtrazione delle perle

NOTA: Se il controllo qualità delle sfere mediante citometria a flusso (fase 8) mostra un'alta percentuale di particolato (70% o superiore), considerare il filtraggio della sospensione del tallone utilizzando il protocollo riportato di seguito (Figura 2).

1. Aggiungere 3,20 ml di HBSS ghiacciato a 0,8 ml della sospensione a cordone TCPP finalizzata al passaggio 7.5 (creazione di una diluizione di cinque volte).
2. Vortex la sospensione del tallone diluito alla massima velocità per 15 s.
3. Rimuovere lo stantuffo da una siringa monouso da 5 ml.
4. Montare la siringa con un filtro a punta in fibra di vetro (5 μm, diametro 13 mm).
5. Aggiungere 4 mL di HBSS alla siringa.
6. Aggiungere 0,5 mL della sospensione a sfere diluite a vortice (punto 9.2).
7. Utilizzare lo stantuffo per filtrare la sospensione attraverso la configurazione della siringa/filtro a circa 2 gocce/s.
8. Lavare le perle aspirando 5 mL di HBSS fresco nella siringa attraverso il filtro a circa 2 gocce/s.
9. Spingere nuovamente l'HBSS nel contenitore dei rifiuti a circa 2 gocce/s.
10. Per rimuovere le sfere dal filtro, aspirare altri 5 ml di HBSS fresco nella siringa attraverso il filtro.
11. Rimuovere con cautela il filtro dalla siringa.
12. Espellere la sospensione del tallone dalla siringa in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.
13. Riposizionare il filtro sulla siringa e ripetere i passaggi 9.10-9.12 altre quattro volte. Quindi gettare il filtro e la siringa.
14. Ripetere i passaggi 9.2-9.13 fino a filtrare tutte le perline del passaggio 9.1. Utilizzare una siringa nuova e filtrare ogni volta.
15. Centrifugare le sospensioni di sfere filtrate per 10 minuti a 1.000 × g a temperatura ambiente.
16. Aspirare il surnatante di ogni tubo da 50 mL e risospendere delicatamente le perle, combinandole in 0,5 mL di HBSS fresco.
17. Trasferire le perle con una micropipetta p1.000 in un nuovo flaconcino di ambra, vetro o polipropilene e conservare a 4 °C.
18. Ripetere il passaggio 8 per determinare se la percentuale di particolato correlato al TCPP nella sospensione del tallone filtrato è diminuita. Per i risultati rappresentativi, vedere la Figura 3.

Risultati

Questo protocollo per l'etichettatura TCPP delle perline è relativamente veloce ed efficiente. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del processo di marcatura delle perline TCPP determinato dalla citometria a flusso. La Figura 1A mostra il profilo standardizzato delle perline arcobaleno, come rilevato nel canale appropriato per il rilevamento di TCPP. Queste perle servono come QC per la standardizzazione delle tensioni laser per il rilevamento di TCPP...

Discussione

Nonostante le numerose applicazioni delle porfirine nella diagnosi e nella terapia del cancro², esiste una letteratura limitata sul loro potenziale uso come reagente citometrico a flusso per l'identificazione di popolazioni cellulari cancerose e non cancerose nei tessuti umani primari^24,25,26. La nostra ricerca sull'analisi citometrica a flusso dell'espettorato umano^24,27

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365