Porphyrin-modifizierte Beads zur Verwendung als Kompensationskontrollen in der Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt, wie Porphyrin-basierte Kompensationsbeads für die Durchflusszytometrie durch die Reaktion von Amin-funktionalisierten Polystyrol-Beads mit dem Porphyrin TCPP und dem Amid-Kupplungsreagenz EDC hergestellt werden. Ein Filtrationsverfahren wird eingesetzt, um die partikulären Nebenprodukte zu reduzieren.

Zusammenfassung

Die Durchflusszytometrie kann verschiedene Zellpopulationen auf der Grundlage von Fluoreszenzmessungen schnell charakterisieren und quantifizieren. Die Zellen werden zunächst mit einem oder mehreren fluoreszierenden Reagenzien gefärbt, die jeweils mit einem anderen fluoreszierenden Molekül (Fluorophor) funktionalisiert werden, das aufgrund ihrer phänotypischen Eigenschaften, wie z. B. der Antigenexpression auf der Zelloberfläche, selektiv an Zellen bindet. Die Intensität der Fluoreszenz von jedem Reagenz, das an Zellen gebunden ist, kann auf dem Durchflusszytometer mit Kanälen gemessen werden, die einen bestimmten Wellenlängenbereich erfassen. Wenn mehrere Fluorophore verwendet werden, schwappt das Licht einzelner Fluorophore oft in unerwünschte Detektionskanäle über, was eine Korrektur der Fluoreszenzintensitätsdaten in einem Prozess erfordert, der als Kompensation bezeichnet wird.

Kompensationskontrollpartikel, in der Regel Polymerkügelchen, die an einen einzelnen Fluorophor gebunden sind, werden für jeden Fluorophor benötigt, der in einem Zellmarkierungsexperiment verwendet wird. Daten von Kompensationspartikeln aus dem Durchflusszytometer werden verwendet, um eine Korrektur der Fluoreszenzintensitätsmessungen vorzunehmen. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Aufreinigung von Polystyrol-Kompensationskügelchen, die kovalent mit dem fluoreszierenden Reagenz Meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphin (TCPP) funktionalisiert sind, und deren Anwendung in der Durchflusszytometrie-Kompensation. In dieser Arbeit wurden aminfunktionalisierte Polystyrolkügelchen mit TCPP und dem Amid-Kupplungsreagenz EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid) bei pH 6 und bei Raumtemperatur für 16 h unter Rühren behandelt. Die TCPP-Beads wurden durch Zentrifugation isoliert und zur Lagerung in einem pH-7-Puffer resuspendiert. TCPP-bedingte Partikel wurden als Nebenprodukt beobachtet. Die Anzahl dieser Partikel könnte durch ein optionales Filtrationsprotokoll reduziert werden. Die daraus resultierenden TCPP-Beads wurden erfolgreich auf einem Durchflusszytometer zur Kompensation in Experimenten mit humanen Sputumzellen eingesetzt, die mit mehreren Fluorophoren markiert waren. Die TCPP-Kügelchen erwiesen sich nach 300-tägiger Lagerung im Kühlschrank als stabil.

Einleitung

Porphyrine sind aufgrund ihrer Fluoreszenz- und Tumor-Targeting-Eigenschaften seit vielen Jahren im biomedizinischen Bereich von Interesse ^1,2,3. Therapeutische Anwendungen wie die photodynamische Therapie (PDT) und die sonodynamische Therapie (SDT) beinhalten die systemische Verabreichung eines Porphyrins an einen Krebspatienten, die Akkumulation des Medikaments im Tumor und die lokale Exposition des Tumors mit einem Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge oder Ultraschall. Die Bestrahlung mit Laserlicht oder Ultraschall führt zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch da....

Protokoll

Alle Verfahren müssen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.

1. Herstellung der TCPP-Stammlösung, 1,0 mg/ml

HINWEIS: Dies kann monatlich erstellt werden.

1. Wiegen Sie mit einer Analysenwaage, einem Spatel und einem Wiegepapier 49,0 bis 50,9 mg TCPP ab. Runden Sie das Gewicht auf 1/10 Milligramm. Stellen Sie die gemessene Menge an TCPP lichtgeschützt beiseite.
   Anmerkungen: Verwenden Sie eine statische Pistole, wenn die Gewichtsanzeige instabil ist.
2. Bestimmen Sie die erforderlichen Mengen an gereinigtem Wasser und Isopropanol (IPA) aus Tabelle....

Diskussion

Trotz der zahlreichen Anwendungen von Porphyrinen in der Krebsdiagnostik und -therapie² gibt es nur begrenzte Literatur über ihre potenzielle Verwendung als durchflusszytometrisches Reagenz zur Identifizierung von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellpopulationen in primären menschlichen Geweben^24,25,26. Unsere Forschung zur durchflusszytometrischen Analyse von humanem Sputum^24,27

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene	Research Products International	ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead	Spherotech	APX-100-10	Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifuge			with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%	Sigma	03450-1G	CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)	BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)	Thomas Scientific	1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, ACS grade	Fisher Scientific	AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips	Eppendorf	3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt	Sigma	M0164	CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer	Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software	Olympus		or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)	Pipete.com	DP101
Plastic Syringe, 5 mL	Fisher Scientific	14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm	Spherotech	PP-100-10
Polypropylene tubes, 15mL, conical	Fisher Scientific	14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom	Fisher Scientific	14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S6014	CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific	Fisher Scientific	50-393-68	CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)	Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator	Thermo Fisher	88881001
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365